pharmjournalРазработка и регистрация лекарственных средствDrug development & registration2305-20662658-5049LLC «CPHA»10.33380/2305-2066-2023-12-2-87-94pharmjournal-1487Research ArticleМЕТОДЫ АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВANALYTICAL METHODSМетодика тестирования лекарственных средств на принадлежность к субстратам и ингибиторам белка-транспортера BCRP на клетках линии Caco-2Method for Testing of Drugs Belonging to Substrates and Inhibitors of the Transporter Protein BCRP on Caco-2 Cellshttps://orcid.org/0000-0001-5068-1201ТрановаЮ. С.TranovaYu. S.

390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

9, Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026

https://orcid.org/0000-0003-0696-6554СлепневА. А.SlepnevA. A.

390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

9, Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026

https://orcid.org/0000-0002-5618-7607ЧерныхИ. В.ChernykhI. V.

390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

9, Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026

Ivchernykh88@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1688-0017ЩулькинА. В.ShchulkinA. V.

390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

9, Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026

https://orcid.org/0000-0001-7829-2494МыльниковП. Ю.MylnikovP. Yu.

390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

9, Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026

https://orcid.org/0000-0002-5166-8372ПоповаН. М.PopovaN. M.

390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

9, Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026

https://orcid.org/0000-0003-1273-520XПоветкоМ. И.PovetkoM. I.

390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

9, Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026

https://orcid.org/0000-0001-6887-4888ЯкушеваЕ. Н.YakushevaE. N.

390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

9, Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026

ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России)Ryazan State Medical University named after academician I. P. Pavlov2023280520231228794Copyright © Транова Ю.С., Слепнев А.А., Черных И.В., Щулькин А.В., Мыльников П.Ю., Попова Н.М., Поветко М.И., Якушева Е.Н., 20232023Транова Ю.С., Слепнев А.А., Черных И.В., Щулькин А.В., Мыльников П.Ю., Попова Н.М., Поветко М.И., Якушева Е.Н.Tranova Y.S., Slepnev A.A., Chernykh I.V., Shchulkin A.V., Mylnikov P.Y., Popova N.M., Povetko M.I., Yakusheva E.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmjournal.ru/jour/article/view/1487Введение

Введение. Белок резистентности рака молочной железы (BCRP) является эффлюксным мембранным транспортером, контролирующим фармакокинетику большого числа лекарственных средств. Его активность может изменяться на фоне приема ряда эндо- и экзогенных веществ, таким образом, делая его звеном межлекарственных взаимодействий.

Цель

Цель. Цель исследования – разработка методики тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам и ингибиторам BCRP in vitro.

Материалы и методы

Материалы и методы. Работа выполнена на клетках Сасо-2 гиперэкспрессирующих BCRP; культивирование проводили в трансвелл-системе, состоящей из апикальной и базолатеральной камер. На дно апикальной камеры (полупроницаемая мембрана) высеивали клетки. Оценивался транспорт субстратов BCRP: метотрексата, митоксантрона и кверцетина в концентрациях 1–50 мкМ в направлении из базолатеральной камеры в апикальную (Papp b-a) и в обратном направлении (Papp a-b). Отношение Papp b-a / Papp a-b более «2» характеризует участие транспортера в переносе веществ. Для подтверждения участия BCRP в транспорте тест-субстратов эксперимент проводился с добавлением в камеры ингибитора транспортера – резерпина (50 мкМ). Концентрацию субстратов определяли методом ВЭЖХ-МС/МС.

Результаты и их обсуждение. При добавлении метотрексата (1 мкМ), митоксантрона (1 мкМ) и кверцетина (1−10 мкМ) в обе камеры их содержание в камере-реципиенте не детектировалось. При концентрации метотрексата 5 мкМ отношение Papp b-a / Papp a-b составило 3,38 ± 0,08, что свидетельствует об участии транспортера в его переносе. При концентрации вещества (10 и 50 мкМ) Papp b-a / Papp a-b снижалось до значений ниже «2». При концентрации митоксантрона 5 мкМ Papp b-a / Papp a-b составило 2,72 ± 0,16. Увеличение концентрации до 10 мкМ привело к росту Papp b-a / Papp a-b до 6,18 ± 0,08. При содержании вещества 50 мкМ показатель снижался, но оставался выше значения 2. В концентрации кверцетина 50 мкМ Papp b-a / Papp было ниже «2». Резерпин снижал Papp b-a / Papp a-b метотрексата в 3,31 раза (p = 0,0002), что свидетельствует об устранении асимметрии транспорта вещества. При концентрации митоксантрона 10 мкМ резерпин снижал его Papp b-a / Papp a-b в 3,36 раза (p < 0,0001). Результаты свидетельствуют об участии BCRP в контроле переноса обоих веществ через клеточный монослой.

Заключение

Заключение. Разработана и апробирована на клетках линии Caco-2 методика тестирования лекарственных средств на принадлежность к субстратам и ингибиторам BCRP с использованием в качестве маркерных субстратов метотрексата (5 мкМ) и митоксантрона (10 мкМ), а в качестве ингибитора – резерпина (50 мкМ).

Introduction

Introduction. Breast cancer resistance protein (BCRP) is an efflux membrane transporter that controls the pharmacokinetics of a large number of drugs. Its activity may change when taking some endo- and exogenous substances, thus making it a link in drug interactions.

Aim

Aim. The aim of the study was to develop a method for testing of drugs for belonging to BCRP substrates and inhibitors in vitro.

Materials and methods

Materials and methods. The work was performed on Caco-2 cells overexpressing BCRP, the cultivation was performed in a transwell-system consisting of the apical and basolateral chambers. Cells were seeded at the bottom of the apical chamber, which is a semipermeable membrane. Primarily, the transport of BCRP substrates: methotrexate, mitoxantrone and quercetin was evaluated in the concentration range of 1, 5, 10, and 50 μM in the direction from the basal chamber to the apical one (Papp b-a) and in the opposite direction (Papp a-b). The ratio Papp b-a / Papp a-b more than «2» characterizes the participation of transporter proteins in the transcellular transport of substances. To confirm the participation of BCRP in their transport the experiment was carried out with the addition of a transporter inhibitor, reserpine, to the transport medium at a concentration of 50 μM. The concentration of substrates in the chambers was analyzed by HPLC-MS/MS.

Results and their discussion. The addition of methotrexate (1 μM), mitoxantrone (1 μM), and quercetin (1–10 μM) to both the apical or basolateral chambers of the transwell-system, their content in the recipient chamber was not detected. When methotrexate concentration became 5 μM the Papp b-a / Papp a-b ratio was 3.38 ± 0.08, which indicates the involvement of transporters in its transfer. The addition of methotrexate to the donor chamber at concentrations of 10 and 50 μM, Papp b-a / Papp a-b decreased to values below «2». At mitoxantrone concentration of 5 μM Papp b-a / Papp a-b was 2.72 ± 0.16. An increase in the concentration to 10 μM led to an increase in Papp b-a / Papp a-b to 6.18 ± 0.08. With a substance content of 50 μM the indicator decreased but remained above the value «2». In the quercetin concentration of 50 microns, Papp b-a / Papp was below "2". Reserpine reduced Papp b-a / Papp a-b of methotrexate by 3.31 times (p = 0.0002), which indicates the elimination of asymmetry in the transport of the substance. At a mitoxantrone concentration of 10 microns, reserpine reduced its Papp b-a / Papp a-b by 3.36 times (p < 0.0001). The results indicate the participation of BCRP in the control of the transfer of both substances through the cellular monolayer.

Conclusion

Conclusion. A method of testing drugs belonging to BCRP substrates and inhibitors using methotrexate (5 μM) and mitoxantrone (10 μM) as marker substrates and reserpine (50 μM) as inhibitor was developed and tested on Caco-2 cells.

BCRPкультура клеток Сасо-2эффлюкссубстратыингибиторыметотрексатмитоксантронкверцетинрезерпинBCRPCaco-2 cell cultureeffluxsubstratesinhibitorsmethotrexatemitoxantronequercetinreserpineReferencesSarkadi B., Homolya L., Hegedus T. The ABCG2/BCRP transporter and its variants – from structure to pathology. FEBS Lett. 2020;594(23):4012–4034. DOI: 10.1002/1873-3468.13947.Sarkadi B., Homolya L., Hegedus T. The ABCG2/BCRP transporter and its variants – from structure to pathology. FEBS Lett. 2020;594(23):4012–4034. DOI: 10.1002/1873-3468.13947.Doyle L. A., Yang W., Abruzzo L. V., Krogmann T., Gao Y., Rishi A. K., Ross D. D. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1998;95(26):15665–15670. DOI: 10.1073/pnas.95.26.15665.Doyle L. A., Yang W., Abruzzo L. V., Krogmann T., Gao Y., Rishi A. K., Ross D. D. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1998;95(26):15665–15670. DOI: 10.1073/pnas.95.26.15665.Maliepaard M., Scheffer G. L., Faneyte I. F., van Gastelen M. A., Pijnenborg A. C., Schinkel A. H., van De Vijver M. J., Scheper R. J., Schellens J. H. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Research. 2001;61(8):3458–3464.Maliepaard M., Scheffer G. L., Faneyte I. F., van Gastelen M. A., Pijnenborg A. C., Schinkel A. H., van De Vijver M. J., Scheper R. J., Schellens J. H. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Research. 2001;61(8):3458–3464.Jonker J. W., Smit J. W., Brinkhuis R. F., Maliepaard M., Beijnen J. H., Schellens J. H., Schinkel A. H. Role of breast cancer resistance protein in the bioavailability and fetal penetration of topotecan. Journal of the National Cancer Institute. 2000;92(20):1651–1656. DOI: 10.1093/jnci/92.20.1651.Jonker J. W., Smit J. W., Brinkhuis R. F., Maliepaard M., Beijnen J. H., Schellens J. H., Schinkel A. H. Role of breast cancer resistance protein in the bioavailability and fetal penetration of topotecan. Journal of the National Cancer Institute. 2000;92(20):1651–1656. DOI: 10.1093/jnci/92.20.1651.Mao Q., Unadkat J. D. Role of the breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in drug transport--an update. The AAPS Journal. 2015;17(1):65–82. DOI: 10.1208/s12248-014-9668-6.Mao Q., Unadkat J. D. Role of the breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in drug transport--an update. The AAPS Journal. 2015;17(1):65–82. DOI: 10.1208/s12248-014-9668-6.Bircsak K. M., Gibson C. J., Robey R. W., Aleksunes L. M. Assessment of drug transporter function using fluorescent cell imaging. Current Protocols in Toxicology. 2013;57(1). DOI: 10.1002/0471140856.tx2306s57.Bircsak K. M., Gibson C. J., Robey R. W., Aleksunes L. M. Assessment of drug transporter function using fluorescent cell imaging. Current Protocols in Toxicology. 2013;57(1). DOI: 10.1002/0471140856.tx2306s57.Zhang Y., Gupta A., Wang H., Zhou L., Vethanayagam R. R., Unadkat J. D., Mao Q. BCRP transports dipyridamole and is inhibited by calcium channel blockers. Pharmaceutical Research. 2005;22(12):2023–2034. DOI: 10.1007/s11095-005-8384-4.Zhang Y., Gupta A., Wang H., Zhou L., Vethanayagam R. R., Unadkat J. D., Mao Q. BCRP transports dipyridamole and is inhibited by calcium channel blockers. Pharmaceutical Research. 2005;22(12):2023–2034. DOI: 10.1007/s11095-005-8384-4.Yasuda K., Ganguly S., Schuetz E. G., Pheophorbide A. Fluorescent Bcrp Substrate to Measure Oral Drug-Drug Interactions in Real-Time In Vivo. Drug Metabolism and Disposition. 2018;46(11):1725–1733. DOI: 10.1124/dmd.118.083584.Yasuda K., Ganguly S., Schuetz E. G., Pheophorbide A. Fluorescent Bcrp Substrate to Measure Oral Drug-Drug Interactions in Real-Time In Vivo. Drug Metabolism and Disposition. 2018;46(11):1725–1733. DOI: 10.1124/dmd.118.083584.Mukkavilli R., Jadhav G., Vangala S. Evaluation of Drug Transport in MDCKII-Wild Type, MDCKII-MDR1, MDCKII-BCRP and Caco-2 Cell Lines. Current Pharmaceutical Biotechnology. 2017;18(14):1151–1158. DOI: 10.2174/1389201019666180308091855.Mukkavilli R., Jadhav G., Vangala S. Evaluation of Drug Transport in MDCKII-Wild Type, MDCKII-MDR1, MDCKII-BCRP and Caco-2 Cell Lines. Current Pharmaceutical Biotechnology. 2017;18(14):1151–1158. DOI: 10.2174/1389201019666180308091855.Sesink A. L., Arts I. C., de Boer V. C., Breedveld P., Schellens J. H., Hollman P. C., Russel F. G. Breast cancer resistance protein (Bcrp1/Abcg2) limits net intestinal uptake of quercetin in rats by facilitating apical efflux of glucuronides. Molecular Pharmacology. 2005;67(6):1999–2006. DOI: 10.1124/mol.104.009753.Sesink A. L., Arts I. C., de Boer V. C., Breedveld P., Schellens J. H., Hollman P. C., Russel F. G. Breast cancer resistance protein (Bcrp1/Abcg2) limits net intestinal uptake of quercetin in rats by facilitating apical efflux of glucuronides. Molecular Pharmacology. 2005;67(6):1999–2006. DOI: 10.1124/mol.104.009753.Якушева Е. Н., Щулькин А. В., Черных И. В., Попова Н. М., Котлярова А. А., Слепнев А. А. Метод анализа принадлежности лекарственных веществ к субстратам и ингибиторам белка-транспортера гликопротеина-P in vitro. Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2019;17(1):71–78. DOI: 10.17816/RCF17171-78.Yakusheva E. N., Shchulkin A. V., Chernykh I. V., Popova N. M., Kotlyarova A. A., Slepnev A. A. Assessment of drugs belonging to inhibitors and inductors of P-glycoprotein in vitro. Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy. 2019;17(1):71–78. (In Russ.) DOI: 10.17816/RCF17171-78.Hilgers A. R., Conradi R. A., Burton P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 1990;7(9):902–910. DOI: 10.1023/a:1015937605100.Hilgers A. R., Conradi R. A., Burton P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 1990;7(9):902–910. DOI: 10.1023/a:1015937605100.Elsby R., Surry D. D., Smith V. N., Gray A. J. Validation and application of Caco-2 assays for the in vitro evaluation of development candidate drugs as substrates or inhibitors of P-glycoprotein to support regulatory submissions. Xenobiotica. 2008;38(7–8):1140–1164. DOI: 10.1080/00498250802050880.Elsby R., Surry D. D., Smith V. N., Gray A. J. Validation and application of Caco-2 assays for the in vitro evaluation of development candidate drugs as substrates or inhibitors of P-glycoprotein to support regulatory submissions. Xenobiotica. 2008;38(7–8):1140–1164. DOI: 10.1080/00498250802050880.Щулькин А. В., Абаленихина Ю. В., Черных И. В., Ерохина П. Д., Якушева Е. Н. Роль P-гликопротеина в ограничении проницаемости клеточных мембран при окислительном стрессе. Биохимия. 2021;86(2):236–247. DOI: 10.31857/S0320972521020081.Shchulkin A. V., Abalenikhina Yu. V., Chernykh I. V., Erokhina P. D., Yakusheva E. N. Role P-glycoprotein in limitation of permeability of cell membranes during oxidative stress. Biochemistry. 2021;86(2):236–247. (In Russ.) DOI: 10.31857/S0320972521020081.Maksimovic V., Pavlovic-Popovic Z., Vukmirovic S., Cvejic J., Mooranian A., Al-Salami H., Mikov M., Golocorbin-Kon S. Molecular mechanism of action and pharmacokinetic properties of methotrexate. Molecular Biology Reports. 2020;47(6):4699–4708. DOI: 10.1007/s11033-020-05481-9.Maksimovic V., Pavlovic-Popovic Z., Vukmirovic S., Cvejic J., Mooranian A., Al-Salami H., Mikov M., Golocorbin-Kon S. Molecular mechanism of action and pharmacokinetic properties of methotrexate. Molecular Biology Reports. 2020;47(6):4699–4708. DOI: 10.1007/s11033-020-05481-9.Li H., Li J., Liu L., Zhang Y., Luo Y., Zhang X., Yang P., Zhang M., Yu W., Qu S. Elucidation of the Intestinal Absorption Mechanism of Celastrol Using the Caco-2 Cell Transwell Model. Planta Medica. 2016;82(13):1202–1207. DOI: 10.1055/s-0035-1568597.Li H., Li J., Liu L., Zhang Y., Luo Y., Zhang X., Yang P., Zhang M., Yu W., Qu S. Elucidation of the Intestinal Absorption Mechanism of Celastrol Using the Caco-2 Cell Transwell Model. Planta Medica. 2016;82(13):1202–1207. DOI: 10.1055/s-0035-1568597.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.