pharmjournalРазработка и регистрация лекарственных средствDrug development & registration2305-20662658-5049LLC «CPHA»10.33380/2305-2066-2023-12-3-229-239pharmjournal-1562Research ArticleДОКЛИНИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯPRECLINICAL AND CLINICAL STUDIESОпределение фавипиравира в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МСDetermination of Favipiravir in Human Blood Plasma by HPLC-MS/MShttps://orcid.org/0000-0001-8354-7877КомаровТ. Н.KomarovT. N.

117149, г. Москва, Симферопольский бульвар, д. 8; 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6

8, Simferopolsky Boulevard, Moscow, 117149; 6, Mikluho-Maklaya str., Moscow, 117198

https://orcid.org/0000-0001-6777-5976КарповаП. А.KarpovaP. A.

117149, г. Москва, Симферопольский бульвар, д. 8

8, Simferopolsky Boulevard, Moscow, 117149

p.karpova@cpha.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6621-1060АрчаковаО. А.ArchakovaO. A.

117149, г. Москва, Симферопольский бульвар, д. 8

8, Simferopolsky Boulevard, Moscow, 117149

https://orcid.org/0000-0003-4894-7001ЩелгачеваД. С.ShchelgachevaD. S.

117149, г. Москва, Симферопольский бульвар, д. 8

8, Simferopolsky Boulevard, Moscow, 117149

https://orcid.org/0000-0002-7518-0777КарнаковаП. К.KarnakovaP. K.

117149, г. Москва, Симферопольский бульвар, д. 8

8, Simferopolsky Boulevard, Moscow, 117149

https://orcid.org/0000-0001-7496-8186БагаеваН. С.BagaevaN. S.

117149, г. Москва, Симферопольский бульвар, д. 8

8, Simferopolsky Boulevard, Moscow, 117149

https://orcid.org/0000-0002-7348-9412ЗаславскаяК. Я.ZaslavskayaK. Ya.

129090, г. Москва, Проспект Мира, д. 13 стр. 1

13/1, Prospekt Mira, Moscow, 129090

https://orcid.org/0000-0001-5998-4874БелыйП. А.BelyP. A.

129090, г. Москва, Проспект Мира, д. 13 стр. 1

13/1, Prospekt Mira, Moscow, 129090

https://orcid.org/0000-0002-1185-8630ШохинИ. Е.ShohinI. E.

117149, г. Москва, Симферопольский бульвар, д. 8

8, Simferopolsky Boulevard, Moscow, 117149

Общество с ограниченной ответственностью «Центр фармацевтической аналитики»; Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы» (РУДН)LLC "Center for Pharmaceutical Analytics"; Peoples' Friendship University of Russia named after Patrice Lumumba (RUDN University)Общество с ограниченной ответственностью «Центр фармацевтической аналитики»LLC "Center for Pharmaceutical Analytics"Общество с ограниченной ответственностью «ПРОМОМЕД РУС»LLC «PROMOMED RUS»202301092023123229239Copyright © Комаров Т.Н., Карпова П.А., Арчакова О.А., Щелгачева Д.С., Карнакова П.К., Багаева Н.С., Заславская К.Я., Белый П.А., Шохин И.Е., 20232023Комаров Т.Н., Карпова П.А., Арчакова О.А., Щелгачева Д.С., Карнакова П.К., Багаева Н.С., Заславская К.Я., Белый П.А., Шохин И.Е.Komarov T.N., Karpova P.A., Archakova O.A., Shchelgacheva D.S., Karnakova P.K., Bagaeva N.S., Zaslavskaya K.Y., Bely P.A., Shohin I.E.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmjournal.ru/jour/article/view/1562Введение

Введение. Одним из наиболее известных препаратов широкого спектра действия против многих РНК-вирусов, в том числе и вируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 [severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)] является фавипиравир. За счет своей структуры фавипиравир встраивается в РНК вируса и блокирует его дальнейшую репликацию в клетке организма человека. Также фавипиравир указан в перечне жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов, что подтверждает значимость для российского здравоохранения этого лекарственного средства в борьбе с распространенными РНК-вирусами. Нами уже были опубликованы биоаналитические методики определения фавипиравира в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектором (ВЭЖХ-УФ) с целью изучения фармакокинетики фавипиравира при парентеральном введении (аналитический диапазон методики составил 0,25–200,00 мкг/мл для дозировки фавипиравира 400 мг в 1 флаконе лиофилизата для приготовления концентрата для приготовления раствора для инфузий) и методом ВЭЖХ с тандемным масс-селективным детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) с целью изучения фармакокинетики β-D-N4-гидроксицитидина и фавипиравира при их совместном определении в плазме крови при пероральном введении (аналитический диапазон методики составил 250,00– 20000,00 нг/мл для дозировки фавипиравира 400 мг в 1 таблетке). Ожидание низких значений концентраций фавипиравира (в данном исследовании дозировка фавипиравира в рассматриваемых лекарственных средствах составляет 200 мг в 1 таблетке) и, в связи с этим расширение диапазона за счет снижения значения нижнего предела количественного определения (НПКО), применяемого в данном исследовании, обуславливает необходимость разработки другой методики. Поэтому в настоящем исследовании освещается разработка и валидация методики определения фавипиравира в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС с аналитическим диапазоном 50,00– 15000,00 нг/мл.

Цель

Цель. Разработка и валидация методики определения фавипиравира в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС для дальнейшего исследования фармакокинетики и биоэквивалентности лекарственных средств фавипиравира является целью настоящего исследования.

Материалы и методы

Материалы и методы. В процессе пробоподготовки использовался способ осаждения белков метанолом. Раствор меченного стабильными изотопами фавипиравира-13С3 применялся как внутренний стандарт, подвижной фазой служили 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в воде (элюент А) и метанол (элюент В). Хроматографическая колонка – Phenomenex Kinetex C18, 100 × 3,0 мм. Определение фавипиравира в плазме крови человека проводили методом ВЭЖХ посредством тандемного масс-спектрометрического детектора с тройным квадруполем. Аналитический диапазон для фавипиравира – 50,00–15000,00 нг/мл в плазме крови человека.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Проведение валидации разработанной методики было осуществлено по следующим параметрам: селективность, калибровочная кривая, точность, прецизионность, эффект матрицы, перенос пробы, степень извлечения, НПКО, стабильность (стабильность исходных и рабочих стандартных растворов аналита; краткосрочная стабильность; стабильность при трехкратной заморозке-разморозке; долгосрочная стабильность аналита в матрице).

Заключение

Заключение. Разработана и валидирована методика количественного определения фавипиравира в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС с подтвержденным аналитическим диапазоном 50,00–15000,00 нг/мл в плазме крови человека. Данная методика позволяет использовать ее для аналитической части исследований фармакокинетики и биоэквивалентности лекарственных средств, содержащих фавипиравир, с целью расширения их ассортимента на отечественном фармацевтическом рынке.

Introduction

Introduction. Favipiravir is one of the most well-known broad-spectrum drugs against many RNA viruses, including the severe acute respiratory syndrome virus 2 [severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)]. Due to its structure, favipiravir is embedded in the RNA of the virus and blocks its further replication in the cell of the human body. Favipiravir is also included in the list of vital and essential medicines, which confirms the importance for Russian healthcare of this drug in the fight against common RNA viruses. We have already published bioanalytical methods for determining favipiravir in human blood plasma by high-performance liquid chromatography with an ultraviolet detector (HPLC–UV) in order to study the pharmacokinetics of favipiravir with parenteral administration (the analytical range of the technique was 0.25–200.00 µg/ ml for the dosage of favipiravir 400 mg in 1 vial of lyophilizate for the preparation of concentrate for the preparation of solution for infusions) and by HPLC with tandem mass-selective detection (HPLC-MS/MS) in order to study the pharmacokinetics of β-D-N4-hydroxycytidine and favipiravir in their joint determination in blood plasma with oral administration (the analytical range of the technique was 250.00–20000.00 ng/ml for the dosage of favipiravir 400 mg in 1 tablet). The expectation of low favipiravir’s concentrations (the dosage of favipiravir in the drugs in question is 200 mg in 1 tablet in this study) and, in this regard, the expansion of the range by reducing the value of the lower limit of quantitative determination (LLOQ) used in this study necessitates the development of another method. Therefore, this study is given the development and validation of a method for determining favipiravir in human blood plasma by HPLC-MS/MS with an analytical range of 50.00–15000.00 ng/ml.

Aim

Aim. The aim of this study is to develop a method for quantitative determination of favipiravir in human blood plasma by HPLC-MS/MS for further for further researches of pharmacokinetics and bioequivalence of drugs.

Materials and methods

Materials and methods. In the process of sample preparation, a method of proteins precipitation with methanol was used. A solution labeled with stable isotopes of favipiravir-13C3 was used as an internal standard, the mobile phase was a 0.1 % solution of formic acid in water (eluent A) and methanol (eluent B). Chromatographic column – Phenomenex Kinetex C18, 100×3.0 mm. The determination of favipiravir in human blood plasma was carried out by HPLC using a tandem mass spectrometric detector with a triple quadrupole. The analytical range for favipiravir is 50.00– 15000.00 ng/ml in human blood plasma.

Results and discussion

Results and discussion. This method was validated by selectivity, calibration curve, accuracy, precision, matrix effect, spike recovery, carry-over effect, the lower limit of quantification and stability.

Conclusion

Conclusion. A method of quantitative favipiravir’s determination in human blood plasma by HPLC-MS/MS with a confirmed analytical range of 50.00–15000.00 ng/ml in human blood plasma has been developed and validated. This method allows using it for the analytical part of pharmacokinetics and bioequivalence studies of drugs containing favipiravir in order to expand their range in the domestic pharmaceutical market.

фавипиравирплазмаCOVID-19валидацияВЭЖХ-МС/МСфармакокинетикабиоэквивалентностьfavipiravirhuman blood plasmavalidationCOVID-19validationHPLC-MS/MSpharmacokineticsbioequivalenceReferencesБалакин К. В., Стороженко Р. В., Якубова Е. В. Фавипиравир как средство терапии COVID-19. Научный бюллетень ХимРар. 2023:1;1–26.Balakin K. V., Storozhenko R. V., Yakubova E. V. Favipiravir as a Means of Therapy of COVID-19. Nauchny bulleten. Scientific Bulletin of Chemrar. 2023;1:1–26. (In Russ.)Furuta Y., Gowen B. B., Takahashi K., Smee D. F., Barnard D. L. Favipiravir (T-705), a Novel Viral RNA Polymerase Inhibitor. Antiviral research. 2013;100(2):446–454. DOI: 10.1016/j.antiviral.2013.09.015.Furuta Y., Gowen B. B., Takahashi K., Smee D. F., Barnard D. L. Favipiravir (T-705), a Novel Viral RNA Polymerase Inhibitor. Antiviral research. 2013;100(2):446–454. DOI: 10.1016/j.antiviral.2013.09.015.Peng Q., Peng R., Yuan B., Wang M., Zhao J., Fu L., Qi J., Shi Y. Structural Basis of SARSCoV-2 Polymerase Inhibition by Favipiravir. The Innovation. 2021;2(1):100080. DOI: 10.1016/j.xinn.2021.100080.Peng Q., Peng R., Yuan B., Wang M., Zhao J., Fu L., Qi J., Shi Y. Structural Basis of SARSCoV-2 Polymerase Inhibition by Favipiravir. The Innovation. 2021;2(1):100080. DOI: 10.1016/j.xinn.2021.100080.Shannon A., Selisko B., Le NTT, Huchting J., Touret F., Piorkowski G., Fattorini V., Ferron F., Decroly E., Meier C., Coutard B., Peersen O., Canard B. Favipiravir strikes the SARS-CoV-2 at its Achilles heel, the RNA polymerase. BioRxiv. 2020. DOI: 10.1101/2020.05.15.098731.Shannon A., Selisko B., Le NTT, Huchting J., Touret F., Piorkowski G., Fattorini V., Ferron F., Decroly E., Meier C., Coutard B., Peersen O., Canard B. Favipiravir strikes the SARS-CoV-2 at its Achilles heel, the RNA polymerase. BioRxiv. 2020. DOI: 10.1101/2020.05.15.098731.Du Y. X., Chen X. P. Favipiravir: Pharmacokinetics and Concerns about Clinical Trials for 2019‐nCoV Infection. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 2020;108(2):242–247. DOI: 10.1002/cpt.1844.Du Y. X., Chen X. P. Favipiravir: Pharmacokinetics and Concerns about Clinical Trials for 2019‐nCoV Infection. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 2020;108(2):242–247. DOI: 10.1002/cpt.1844.Sood S., Bhatia G. K., Seth P., Kumar P., Kaur J., Gupta V., Punia S., Tuli H. S. Efficacy and Safety of New and Emerging Drugs for COVID-19: Favipiravir and Dexamethasone. Current Pharmacology Reports. 2021;7:49–54. DOI: 10.1007/s40495-021-00253-w.Sood S., Bhatia G. K., Seth P., Kumar P., Kaur J., Gupta V., Punia S., Tuli H. S. Efficacy and Safety of New and Emerging Drugs for COVID-19: Favipiravir and Dexamethasone. Current Pharmacology Reports. 2021;7:49–54. DOI: 10.1007/s40495-021-00253-w.Shiraki K., Sato N., Sakai K., Matsumoyo Sh., Kszynski R. H., Takemoto M. Antiviral Therapy for COVID-19: Derivation of Optimal Strategy Based on Past Antiviral and Favipiravir Experiences. Pharmacology & Therapeutics. 2022;235:108121. DOI: 10.1016/j.pharmthera.2022.108121.Shiraki K., Sato N., Sakai K., Matsumoyo Sh., Kszynski R. H., Takemoto M. Antiviral Therapy for COVID-19: Derivation of Optimal Strategy Based on Past Antiviral and Favipiravir Experiences. Pharmacology & Therapeutics. 2022;235:108121. DOI: 10.1016/j.pharmthera.2022.108121.Карнакова П. К., Комаров Т. Н., Арчакова О. А., Щелгачева Д. С., Алешина А. В., Багаева Н. С., Карпова П. А., Шохин И. Е. Совместное определение кандесартана и гидрохлоротиазида в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021;10(4):177–189. DOI: 10.33380/2305-2066-2021-10-4-177-189.Karnakova P. K., Komarov T. N., Archakova O. A., Shchelgacheva D. S., Aleshina A. A., Bagaeva N. S., Karpova P. A., Shohin I. E. Simultaneous Determination of Candesartan and Hydrochlorothiazide in Human Plasma by HPLC-MS/MS. Drug development & registration. 2021;10(4):177–189. (In Russ.) DOI: 10.33380/2305-2066-2021-10-4-177-189.Tiris G., Gazioglu I., Furton K. G., Kabir A., Locatelli M. Fabric Phase Sorptive Extraction Combined with High Performance Liquid Chromatography for the Determination of Favipiravir in Human Plasma and Breast Milk. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2023;223:115131. DOI: 10.1016/j.jpba.2022.115131.Tiris G., Gazioglu I., Furton K. G., Kabir A., Locatelli M. Fabric Phase Sorptive Extraction Combined with High Performance Liquid Chromatography for the Determination of Favipiravir in Human Plasma and Breast Milk. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2023;223:115131. DOI: 10.1016/j.jpba.2022.115131.Abdallah I. A., Hammad Sh. F., Bedair A., Mansour F. R. Menthol-assisted Homogenous Liquid-Liquid Microextraction for HPLC/UV Determination of Favipiravir as an Antiviral for COVID-19 in Human Plasma. Journal of Chromatography B. 2022;1189:123087. DOI: 10.1016/j.jchromb.2021.123087.Abdallah I. A., Hammad Sh. F., Bedair A., Mansour F. R. Menthol-assisted Homogenous Liquid-Liquid Microextraction for HPLC/UV Determination of Favipiravir as an Antiviral for COVID-19 in Human Plasma. Journal of Chromatography B. 2022;1189:123087. DOI: 10.1016/j.jchromb.2021.123087.Комаров Т. Н., Карнакова П. К., Арчакова О. А., Щелгачева Д. С., Багаева Н. С., Шохин И. Е., Заславская К. Я., Белый П. А. Разработка и валидация методики определения фавипиравира в плазме крови человека методом ВЭЖХ-УФ. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(3):220–229. DOI: 10.33380/2305-2066-2022-11-3-220-229.Komarov T. N., Karnakova P. K., Archakova O. A., Shchelgacheva D. S., Bagaeva N. S., Shohin I. E., Zaslavskaya K. Y., Bely P. A. Development and Validation of HPLC-UV Method for the Determination of Favipiravir in Human Plasma. Drug development & registration. 2022;11(3):220–229. (In Russ.) DOI: 10.33380/2305-2066-2022-11-3-220-229.Abd Allah F. I., Abdelhmaid A., Himida M., Elkashlan A. M., El-Attar A.-A. M. M. Fully Validated UPLC–MS/MS Method for Quantifying Favipiravir in Human Plasma Boosted Lean Six Sigma: An Application For a Bioequivalence Study. Biomedical Chromatography. 2022;36(9):e5381. DOI: 10.1002/bmc.5381.Abd Allah F. I., Abdelhmaid A., Himida M., Elkashlan A. M., El-Attar A.-A. M. M. Fully Validated UPLC–MS/MS Method for Quantifying Favipiravir in Human Plasma Boosted Lean Six Sigma: An Application For a Bioequivalence Study. Biomedical Chromatography. 2022;36(9):e5381. DOI: 10.1002/bmc.5381.Комаров Т. Н., Карнакова П. К., Арчакова О. А., Щелгачева Д. С., Багаева Н. С., Шохин И. Е., Заславская К. Я., Белый П. А. Совместное определение основного метаболита молнупиравира (β-D-N4-гидроксицитидина) и фавипиравира в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2023;12(1):215–226. DOI: 10.33380/2305-2066-2023-12-1-215-226.Komarov T. N., Karnakova P. K., Archakova O. A., Shchelgacheva D. S., Bagaeva N. S., Shohin I. E., Zaslavskaya K. Y., Bely P. A. Simultaneous Determination of Major Molnupiravir Metabolite (β-D-N4-hydroxycytidine) and Favipiravir in Human Plasma by HPLC-MS/MS. Drug development & registration. 2023;12(1):215–226. (In Russ.) DOI: 10.33380/2305-2066-2023-12-1-215-226.Onmaz D. E., Abusoglu S., Omnaz M., Yerlikaya F. H., Unlu A. Development and Validation of a Sensitive, Fast and Simple LC-MS/MS Method for the Quantitation of Favipiravir in Human Serum. Journal of Chromatography B. 2021;1176:122768. DOI: 10.1016/j.jchromb.2021.122768.Onmaz D. E., Abusoglu S., Omnaz M., Yerlikaya F. H., Unlu A. Development and Validation of a Sensitive, Fast and Simple LC-MS/MS Method for the Quantitation of Favipiravir in Human Serum. Journal of Chromatography B. 2021;1176:122768. DOI: 10.1016/j.jchromb.2021.122768.Challenger E., Penchala S. D., Hale C., Fitzgerald R., Walker L., Reynolds H., Chiong J., Fletcher T., Khoo S., Else L. Development and Validation of an LC-MS/MS Method for Quantification of Favipiravir in Human Plasma. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2023;233:115436. DOI: 10.1016/j.jpba.2023.115436.Challenger E., Penchala S. D., Hale C., Fitzgerald R., Walker L., Reynolds H., Chiong J., Fletcher T., Khoo S., Else L. Development and Validation of an LC-MS/MS Method for Quantification of Favipiravir in Human Plasma. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2023;233:115436. DOI: 10.1016/j.jpba.2023.115436.Bekegnran C. P., Driouich J. S., Breuer J., Barthelemy K., Giocanti M., de Lamballerie X., Kreins A. Y., Nougairede A., Solas C. Simultaneous Quantitation of Favipiravir and its Hydroxide Metabolite in Human Plasma and Hamster Matrices Using a UPLC–MS/MS Method. Biomedical Chromatography. 2023;37(9):e5689. DOI: 10.1002/bmc.5689.Bekegnran C. P., Driouich J. S., Breuer J., Barthelemy K., Giocanti M., de Lamballerie X., Kreins A. Y., Nougairede A., Solas C. Simultaneous Quantitation of Favipiravir and its Hydroxide Metabolite in Human Plasma and Hamster Matrices Using a UPLC–MS/MS Method. Biomedical Chromatography. 2023;37(9):e5689. DOI: 10.1002/bmc.5689.Sağlam O., Demiray G., Güney B., Doğan-Kurtoğlu E., Ulusoy M. G., Saraner N., Sevici G., Nacak M., Erenmemişoğlu A., Tüzer V. Single Dose, Two-way Crossover Bioequivalence Study of Favipiravir Tablet in Healthy Male Subjects. Journal of Pharmacy and Drug Development. 2020;2(2):1–9. DOI: 10.5281/zenodo.4361817.Sağlam O., Demiray G., Güney B., Doğan-Kurtoğlu E., Ulusoy M. G., Saraner N., Sevici G., Nacak M., Erenmemişoğlu A., Tüzer V. Single Dose, Two-way Crossover Bioequivalence Study of Favipiravir Tablet in Healthy Male Subjects. Journal of Pharmacy and Drug Development. 2020;2(2):1–9. DOI: 10.5281/zenodo.4361817.Алешина А. В., Комаров Т. Н., Арчакова О. А., Щелгачева Д. С., Багаева Н. С., Давыданова В. В., Савченко А. Ю., Шохин И. Е. Определение транексамовой кислоты в плазме крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021;10(2):120–127. DOI: 10.33380/2305-2066-2021-10-2-120-127.Aleshina A. V., Komarov T. N., Archakova O. A., Shchelgacheva D. S., Bagaeva N. S., Davydanova V. V., Savchenko A. Yu., Shohin I. E. Development and Validation of Tranexamic Acid Determination in Human Plasma by HPLC-MS/MS method. Drug development & registration. 2021;10(2):120–127. (In Russ.) DOI: 10.33380/2305-2066-2021-10-2-120-127.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.