pharmjournalРазработка и регистрация лекарственных средствDrug development & registration2305-20662658-5049LLC «CPHA»10.33380/2305-2066-2023-12-4-1576pharmjournal-1641Research ArticleФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯPHARMACEUTICAL TECHNOLOGYСкрининг противомикробной и антиоксидантной активности шляпочных грибов, произрастающих в Ленинградской областиAntimicrobial and Antioxidant Activity Screening of Mushrooms Growing in the Leningrad Regionhttps://orcid.org/0000-0002-4847-5924УэйлиА. К.WhaleyA. K.

197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, лит. А

14A, Prof. Popova str., Saint-Petersburg, 197022

https://orcid.org/0000-0003-4879-9336УэйлиА. О.WhaleyA. O.

197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, лит. А

14A, Prof. Popova str., Saint-Petersburg, 197022

anastasiya.ponkratova@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4475-4421НовиковаВ. В.NovikovaV. V.

614990, г. Пермь, ул. Полевая, д. 2

2, Polevaya str., Perm, 614990

https://orcid.org/0009-0008-3342-0630ВасильевВ. О.VasilievV. O.

614990, г. Пермь, ул. Полевая, д. 2

2, Polevaya str., Perm, 614990

https://orcid.org/0000-0003-2995-7570КлемперА. В.KlemperA. V.

197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, лит. А

14A, Prof. Popova str., Saint-Petersburg, 197022

https://orcid.org/0000-0001-9547-5372ЛукашовР. И.LukashovR. I.

220116, г. Минск, пр-т Дзержинского, д. 83, лабораторный корпус № 15

Laboratory building No. 15 83, Dzerzhinsky avenue, Minsk, 220116

https://orcid.org/0009-0004-5239-5902МандрикН. И.MandrikN. I.

220116, г. Минск, пр-т Дзержинского, д. 83, лабораторный корпус № 15

Laboratory building No. 15 83, Dzerzhinsky avenue, Minsk, 220116

https://orcid.org/0009-0009-9150-5728ГуринаН. С.GurinaN. S.

220116, г. Минск, пр-т Дзержинского, д. 83, лабораторный корпус № 15

Laboratory building No. 15 83, Dzerzhinsky avenue, Minsk, 220116

https://orcid.org/0009-0009-4570-2739ЯковлевГ. П.YakovlevG. P.

197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, лит. А

14A, Prof. Popova str., Saint-Petersburg, 197022

https://orcid.org/0000-0002-6312-2027ЛужанинВ. Г.LuzhaninV. G.

614990, г. Пермь, ул. Полевая, д. 2

2, Polevaya str., Perm, 614990

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России)РоссияSaint-Petersburg State Chemical and Pharmaceutical UniversityRussian FederationФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО ПГФА Минздрава России)РоссияFederal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Perm State Pharmaceutical Academy" of the Ministry of Health of the Russian FederationRussian FederationУчреждение образования «Белорусский государственный медицинский университет» (БГМУ)БеларусьBelarusian State Medical UniversityBelarus202307112023124111125Copyright © Уэйли А.К., Уэйли А.О., Новикова В.В., Васильев В.О., Клемпер А.В., Лукашов Р.И., Мандрик Н.И., Гурина Н.С., Яковлев Г.П., Лужанин В.Г., 20232023Уэйли А.К., Уэйли А.О., Новикова В.В., Васильев В.О., Клемпер А.В., Лукашов Р.И., Мандрик Н.И., Гурина Н.С., Яковлев Г.П., Лужанин В.Г.Whaley A.K., Whaley A.O., Novikova V.V., Vasiliev V.O., Klemper A.V., Lukashov R.I., Mandrik N.I., Gurina N.S., Yakovlev G.P., Luzhanin V.G.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmjournal.ru/jour/article/view/1641Введение

Введение. Возникновение новых штаммов микроорганизмов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) в отношении применяемых противомикробных лекарственных препаратов, является одной из актуальных проблем современной медицины. Для предотвращения наращивания смертей, связанных с МЛУ, процесс поиска новых антибиотиков и их внедрение в медицинскую практику должны идти непрерывно. Инфекционные заболевания также сопровождаются повреждением клеток и развитием свободнорадикальных процессов окисления, соответственно, поиск новых антиоксидантов – важная задача. С учетом мощного биосинтетического потенциала базидиомицетов данная группа грибов имеет все перспективы стать новым источником биологически активных веществ в целом, а также антибиотиков и антиоксидантов в частности. Шляпочные грибы, представленные преимущественно базидиомицетами, насчитывают около 14 000 видов и являются доступным источником сырья для поиска перспективных антимикробных соединений и антиоксидантов.

Цель

Цель. Изучение антиоксидантной и противомикробной активности суммарных экстрактов, полученных из шляпочных грибов, в отношении Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Candida albicans и оценка пригодности шляпочных грибов для использования в качестве природного источника веществ с противомикробной и антиоксидантной активностью.

Материалы и методы

Материалы и методы. Противогрибковую и антибактериальную активность экстрактов определяли микрометодом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде в 96-луночных планшетах в двух повторах. Изучение данного вида биологической активности осуществляли в отношении референтных (типовых) штаммов Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Escherichia coli ATCC 25922, Candida albicans NCTC 885-653. Для исследований антиоксидантной активности с помощью DPPH использовали спиртовые извлечения из плодовых тел грибов, полученные методом мацерации 96%-м этанолом при соотношении сырья и экстрагента 1 к 8 в течение суток, водный раствор аскорбиновой кислоты (витамина С) и этанольный раствор тролокса.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. В отношении представителя грамположительной флоры S. aureus исследуемые экстракты шляпочных грибов проявили низкую активность, в среднем порядка 2500 или 5000 мкг/мл. В отношении представителя грамотрицательной флоры E. coli 8 % исследуемых экстрактов шляпочных грибов проявили среднюю активность порядка 1250 мкг/мл. Наибольшее количество экстрактов шляпочных грибов – 19 % от всех исследуемых видов проявили активность в отношении дрожжевого микромицета C. albicans. Наиболее высокая активность против C. albicans наблюдалась у экстрактов грибов Cantharellula umbonata с МИК 625 мкг/мл, Cortinarius olivaceofuscus с МИК 625 мкг/мл и Hypomyces chrysospermus с МИК 312 мкг/мл. В ходе скрининга антиоксидантной активности исследуемые извлечения разделили на три группы: с высокой (более 50 % ППР), средней (от 15 до 50 % ППР) и низкой (менее 15 %) антиоксидантной активностью. Было показано, что сумма фенольных соединений значимо коррелирует с уровнем антиоксидантной активности во всех трех группах, но в группах со средней и низкой антиоксидантной активностью присутствуют также другие, нефенольные группы веществ, вносящие значимый вклад в общую антиоксидантную активность.

Заключение

Заключение. Шляпочные грибы представляют собой перспективный источник биологически активных веществ с противогрибковой и антиоксидантной активностью.

Introduction

Introduction. The emergence of new strains of microorganisms that are multidrug resistant (MDR) in relation to the antimicrobial drugs used is one of the pressing problems of modern medicine. To prevent an increase in MDR-related deaths, the search for new antibiotics and their introduction into medical practice must be continuously ongoing. Infectious diseases are also accompanied by cell damage and the development of free radical oxidation processes, therefore the search for new antioxidants is also an important task. Considering the powerful biosynthetic potential of basidiomycetes, this group of fungi has every prospect of becoming a new source of biologically active substances in general, as well as antibiotics and antioxidants in particular. Cap mushrooms, represented mainly by basidiomycetes, number about 14,000 species and are an accessible source of raw materials for the search for promising antimicrobial compounds and antioxidants.

Aim

Aim. Study of the antioxidant and antimicrobial activity of total extracts obtained from cap mushrooms against Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans and assessment of the suitability of cap mushrooms as a natural source of substances with antimicrobial and antioxidant activity.

Materials and methods

Materials and methods. The antifungal and antibacterial activity of the extracts was determined by the micromethod of two-fold serial dilutions in a liquid nutrient medium in 96-well plates in duplicate. The study of this type of biological activity was carried out against reference (type) strains Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Escherichia coli ATCC 25922, Candida albicans NCTC 885-653. To study antioxidant activity using DPPH, we used alcoholic extracts from the fruiting bodies of mushrooms obtained by maceration with 96 % ethanol at a ratio of raw materials to extractant of 1 to 8 for 24 hours, an aqueous solution of ascorbic acid (vitamin C) and an ethanol solution of Trolox.

Result and discussion

Result and discussion. In relation to S. aureus, a representative of gram-positive flora, the studied extracts of cap mushrooms showed low activity, on average about 2500 or 5000 μg/ml. In relation to E. coli, a representative of gram-negative flora, 8 % of the studied cap mushroom extracts showed an average activity of about 1250 μg/ml. The largest number of cap mushroom extracts – 19% of all studied species – showed activity against the yeast micromycete C. albicans. The highest activity against C. albicans was observed in extracts of the mushrooms Cantharellula umbonata with an MIC of 625 μg/ml, Cortinarius olivaceofuscus with an MIC of 625 μg/ml, and Hypomyces chrysospermus with an MIC of 312 μg/ml. During screening of antioxidant activity, the studied extracts were divided into three groups: with high (more than 50 % PPR), medium (from 15 to 50 % PPR) and low (less than 15 %) antioxidant activity. It was shown that the sum of phenolic compounds significantly correlates with the level of antioxidant activity in all three groups, but in the groups with medium and low antioxidant activity there are also other non-phenolic groups of compounds that make a significant contribution to the total antioxidant activity.

Conclusion

Conclusion. Cap mushrooms are a promising source of biologically active substances with antifungal and antioxidant activity.

шляпочные грибыВЭЖХ-скринингантимикробная активностьантиоксидантная активностьcap mushroomsHPLC screeningantimicrobial activityantioxidant activityРезультаты работы получены с использованием оборудования ЦКП «Аналитический центр ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России» в рамках соглашения № 075-15-2021-685 от 26 июля 2021 года при финансовой поддержке Минобрнауки России.The results of the work were obtained using the equipment of the Center for Collective Use "Analytical Center of Saint-Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University" within the framework of agreement No. 075-15-2021-685 dated July 26, 2021 with the financial support of the Ministry of Education and Science of Russia.ReferencesVan Boeckel T. P., Gandra S., Ashok A., Caudron Q., Grenfell B. T., Levin S. A., Laxminarayan R. Global antibiotic consumption 2000 to 2010: an analysis of national pharmaceutical sales data. The Lancet Infectious Diseases. 2014;14(8):742–750.Van Boeckel T. P., Gandra S., Ashok A., Caudron Q., Grenfell B. T., Levin S. A., Laxminarayan R. Global antibiotic consumption 2000 to 2010: an analysis of national pharmaceutical sales data. The Lancet Infectious Diseases. 2014;14(8):742–750.Remesh A., Gayathri A., Singh R., Retnavally K. G. The Knowledge, Attitude and the Perception of Prescribers on the Rational Use of Antibiotics and the Need for an Antibiotic Policy – A Cross Sectional Survey in a Tertiary Care Hospital. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 2013;7(4):675–679.Remesh A., Gayathri A., Singh R., Retnavally K. G. The Knowledge, Attitude and the Perception of Prescribers on the Rational Use of Antibiotics and the Need for an Antibiotic Policy – A Cross Sectional Survey in a Tertiary Care Hospital. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 2013;7(4):675–679.Baran A., Kwiatkowska A., Potocki L. Antibiotics and Bacterial Resistance-A Short Story of an Endless Arms Race. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(6):5777.Baran A., Kwiatkowska A., Potocki L. Antibiotics and Bacterial Resistance-A Short Story of an Endless Arms Race. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(6):5777.Terreni M., Taccani M., Pregnolato M. New Antibiotics for Multidrug-Resistant Bacterial Strains: Latest Research Developments and Future Perspectives. Molecules. 2021;26(9):2671.Terreni M., Taccani M., Pregnolato M. New Antibiotics for Multidrug-Resistant Bacterial Strains: Latest Research Developments and Future Perspectives. Molecules. 2021;26(9):2671.Ахмедов О. Р., Шомуротов Ш. А., Тураев А. С., Сидоренко А. В. Зависимость антимикробных эффектов гуанидинсодержащих производных пектина от некоторых структурных характеристик. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(2):38–45.Akhmedov O. R., Shomurotov S. A., Turaev A. S., Sidarenka A. V. Dependence of Antimicrobial Effects of Guanidine-containing Pectin Derivatives from Some Structural Characteristics. Drug development & registration. 2022;11(2):38–45. (In Russ.)Hyde K. D. The numbers of fungi. Fungal Diversity. 2022;114:1.Hyde K. D. The numbers of fungi. Fungal Diversity. 2022;114:1.Debeljak P., Baltar F. Fungal Diversity and Community Composition across Ecosystems. Journal of Fungi. 2023;9:510.Debeljak P., Baltar F. Fungal Diversity and Community Composition across Ecosystems. Journal of Fungi. 2023;9:510.Avalos J., Limón M. C. Fungal Secondary Metabolism. Encyclopedia. 2022;2:1–13.Avalos J., Limón M. C. Fungal Secondary Metabolism. Encyclopedia. 2022;2:1–13.Ponkratova A. O., Whaley A. K., Balabas O. A., Smirnov S. N., Proksch P., Luzhanin V. G. A new bibenzyl and 9,10-dihydrophenanthrene derivative from aerial parts of crowberry (Empetrum nigrum L.). Phytochemistry letters. 2021;42:15–17.Ponkratova A. O., Whaley A. K., Balabas O. A., Smirnov S. N., Proksch P., Luzhanin V. G. A new bibenzyl and 9,10-dihydrophenanthrene derivative from aerial parts of crowberry (Empetrum nigrum L.). Phytochemistry letters. 2021;42:15–17.Ponkratova A. O., Whaley A. K., Orlova A. A., Smirnov S. N., Serebryakov E. B., Proksch P., Luzhanin V. G. A new dimethoxy dihydrochalcone isolated from the shoots of Empetrum nigrum L. Natural Products Research. 2021:1–6.Ponkratova A. O., Whaley A. K., Orlova A. A., Smirnov S. N., Serebryakov E. B., Proksch P., Luzhanin V. G. A new dimethoxy dihydrochalcone isolated from the shoots of Empetrum nigrum L. Natural Products Research. 2021:1–6.Лужанин В. Г., Уэйли А. К., Понкратова А. О., Гришукова Е. А., Сулоев И. С., Смирнов С. Н., Серебряков Е. Б. Выделение индивидуальных соединений из надземной части стальника полевого (Ononis arvensis L.) и золотарника канадского (Solidago canadensis L.). Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021;10(1):83–89.Luzhanin V. G., Whaley A. K., Ponkratova A. O., Grishukova E. A., Suloev I. S., Smirnov S. N., Serebryakov E. B. Isolation of individual compounds from the aerial part of the field steelhead (Ononis arvensis L.) and goldenrod (Solidago canadensis L.). Drug development & registration. 2021;10(1):83-89. (In Russ.)Уэйли А. К., Понкратова А. О., Орлова А. А., Серебряков Е. Б., Смирнов С. Н., Прокш П., Ионов Н. С., Поройков В. В., Лужанин В. Г. Фитохимический анализ вторичных метаболитов полифенольной природы в листьях морошки обыкновенной (Rubus chamaemorus L.). Химико-фармацевтический журнал. 2021;55(3):22–27.Whaley A. K., Ponkratova A. O., Orlova A. A., Serebryakov E. B., Smirnov S. N., Proksh P., Ionov N. S., Poroikov V. V., Luzhanin V. G. Phytochemical analysis of secondary metabolites of polyphenolic nature in the leaves of cloudberry (Rubus chamaemorus L.). Chemical-Pharmaceutical Journal. 2021;55(3):22–27. (In Russ.)Понкратова А. О., Уэйли А. К., Орлова А. А., Смирнов С. Н., Серебряков С. Н., Лужанин В. Г. Выделение и установление структуры трех димерных проантоцианидинов типа А из надземной части Empetrum nigrum L. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021;10(2):80–86.Ponkratova A. O., Whaley A. K., Orlova A. A., Smirnov S. N., Serebryakov S. N., Luzhanin V. G. Isolation and determination of the structure of three dimeric type A proanthocyanidins from the aerial part of Empetrum nigrum L. Drug development & registration. 2021;10(2):80–86. (In Russ.)Крипак Е. М., Понкратова А. О., Уэйли А. К., Жохова Е. В. Фитохимическое изучение травы вербейника обыкновенного (Lysimachia vulgaris L.): выделение и установление структуры вторичных метаболитов. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(4):170–176.Kripak Е. М., Ponkratova A. O., Whaley A. K., Zhokhova Е. V. Phytochemical Analysis of Lysimachia vulgaris L. Aerial Part: Isolation and Structure Elucidation of Secondary Metabolites. Drug development & registration. 2022;11(4):170–176. (In Russ.)Стругар Й., Орлова А. А., Понкратова А. О., Уэйли А. К., Повыдыш М. Н. Выделение индивидуальных соединений из травы сабельника болотного (Comarum palustre L.) и установление их структуры спектроскопическими методами. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(4):177–184.Strugar Y., Orlova A. A., Ponkratova A. A., Whaley A. K., Povydysh M. N. Isolation of Individual Compounds from the Aerial Part of Comarum palustre L. and Their Structure Elucidation Using Spectroscopic Methods. Drug development & registration. 2022;11(4):177–184. (In Russ.)Богоутдинова А. М., Уэйли А. К., Понкратова А. О., Орлова А. А., Гончаров М. Ю., Шпакова В. С., Фарманова Н. Т., Нуруллаева Д. Х., Шарипов А. Т., Гамбарян С. П., Повыдыш М. Н. Выделения формононетин-7-О-β-D-глюкопиранозида из травы стальника полевого (Ononis arvensis L.) и оценка его влияния на индуцированную активацию тромбоцитов. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021;10(4):14–19.Bogoutdinova A. M., Whaley A. K., Ponkratova A. O., Orlova A. A., Goncharov M. Yu., Shpakova V. S., Farmanova N. T., Nurullaeva D. K., Sharipov A. T., Gambaryan S. P., Povydysh M. N. Isolation of formononetin-7-O-β-D-glucopyranoside from the grass of Ononis arvensis L. and the assessment of its effect on induced platelet activation. Drug development & registration. 2021;10(4):14–19. (In Russ.)Лёзина А. В., Уэйли А. К., Уэйли А. О., Тернинко И. И. Индивидуальные соединения корневищ и корней родиолы четырехлепестной (Rhodoila quadrifida): выделение и установление структуры. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(4):185–193.Lezina A. V., Whaley A. K., Whaley A. O., Terninko I. I. Individual Compounds of Rhodoila quadrifida Rhizomes and Roots: Isolating and Establishing Structure. Drug development & registration. 2022;11(4):185–193. (In Russ.)Whaley A. K., Ebrahim W., El-Neketi M., Ancheeva E. New acetylated flavone C-glycosides from Iris lactea. Tetrahedron Letters. 2017;58(22):2171–2173.Whaley A. K., Ebrahim W., El-Neketi M., Ancheeva E. New acetylated flavone C-glycosides from Iris lactea. Tetrahedron Letters. 2017;58(22):2171–2173.Гуленков А. С., Мизина П. Г., Бахрушина Е. О., Бардаков А. И., Нюдочкин А. В. Фармацевтико-технологическое исследование адсорбированного жидкого растительного экстракта антимикробного действия. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(2):94–101.Gulenkov A. S., Mizina P. G., Bakhrushina E. O., Bardakov A. I., Nyudochkin A.V. Рharmaceutical-technological Study of Adsorbed Liquid Plant Extract of Antimicrobial Activity. Drug development & registration. 2022;11(2):94–101. (In Russ.)Бомбела Т. В., Кроткова О. А., Галишевская Е. Е., Анисимова А. Г., Ягонцева Т. А., Агафонцева А. В., Новикова В. В., Уэйли А. К., Понкратова А. О., Лужанин В. Г. Компонентный состав и противомикробная активность фракций из надземной части льнянки обыкновенной (Linaria vulgaris Mill.). Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(4):48–56Bombela T. V., Krotkova O. A., Galishevskaya E. E., Anisimova A. G., Yagontseva T. A., Agafontseva A. V., Novikova V. V., Whaley A. K., Ponkratova A. O., Luzhanin V. G. Component Composition and Antimicrobial Activity of Fractions from the Aerial Part of Common Toadflax (Linaria vulgaris Mill.). Drug development & registration. 2022;11(4):48–56. (In Russ.)Лужанин В. Г., Уэйли А. К., Понкратова А. О., Новикова В. В., Безверхняя Е. А. Противомикробная активность соединений полифенольной природы. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(2):65–72.Luzhanin V. G., Whaley A. K., Ponkratova A. O., Novikova V. V., Bezverkhnyaya E. A. Antimicrobial activity of compounds of polyphenolic nature. Drug development & registration. 2022;11(2):65–72. (In Russ.)Demain A., Martens E. Production of valuable compounds by molds and yeasts. The Journal of Antibiotics. 2017;70:347–360.Demain A., Martens E. Production of valuable compounds by molds and yeasts. The Journal of Antibiotics. 2017;70:347–360.Alves M. J., Ferreira I. C., Dias J., Teixeira V., Martins A., Pintado M. A review on antimicrobial activity of mushroom (Basidiomycetes) extracts and isolated compounds. Planta Medica. 2012;78(16):1707–1718.Alves M. J., Ferreira I. C., Dias J., Teixeira V., Martins A., Pintado M. A review on antimicrobial activity of mushroom (Basidiomycetes) extracts and isolated compounds. Planta Medica. 2012;78(16):1707–1718.Миронов А. Н. Руководство по проведению доклинических лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К; 2012. 944 с.Mironov A. N. Guidelines for conducting preclinical drug trials. Part 1. Moscow: Grif i K; 2012. 944 p. (In Russ).Новикова В. В., Якимова Е. В., Горбушина А. Д. Исследование новых продуктов органического синтеза на противогрибковую активность в отношении дрожжевых грибов: обоснование выбора условий испытаний. Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2022;3:105–112.Novikova V. V., Yakimova E. V., Gorbushina A. D. Study of new organic synthesis products for antifungal activity against yeast fungi: rationale for choice of test conditions. Proceedings of Voronezh State University. Series: Chemistry. Biology. Pharmacy. 2022;3:105–112. (In Russ.)Dornberger K., Ihn W., Ritzau M., Gräfe U., Schlegel B., Fleck W. F., Metzger J. W. Chrysospermins, new peptaibol antibiotics from Apiocrea chrysosperma Ap101. The Japanese Journal of Antibiotics. 1995;48(9):977–989.Dornberger K., Ihn W., Ritzau M., Gräfe U., Schlegel B., Fleck W. F., Metzger J. W. Chrysospermins, new peptaibol antibiotics from Apiocrea chrysosperma Ap101. The Japanese Journal of Antibiotics. 1995;48(9):977–989.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.