150000, г. Ярославль, ул. Республиканская, д. 108/1; 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, д. 5
108/1, Respublikanskaya str., Yaroslav, 150000; 5, Revolutsionnaya str., Yaroslavl, 150000
150000, г. Ярославль, ул. Республиканская, д. 108/1
108/1, Respublikanskaya str., Yaroslav, 150000
150000, г. Ярославль, ул. Республиканская, д. 108/1
108/1, Respublikanskaya str., Yaroslav, 150000
150000, г. Ярославль, ул. Республиканская, д. 108/1
108/1, Respublikanskaya str., Yaroslav, 150000
150000, г. Ярославль, ул. Республиканская, д. 108/1; 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, д. 5
108/1, Respublikanskaya str., Yaroslav, 150000; 5, Revolutsionnaya str., Yaroslavl, 150000
Введение. Изучение системной экспозиции нового оригинального лекарственного препарата является обязательным этапом его доклинического исследования. 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид является новым селективным ингибитором карбоангидразы II для лечения открытоугольной глаукомы. Методики количественного определения данного соединения и его N-гидрокси- и N-ацетилметаболитов в плазме лабораторных животных ранее разработаны не были.
Цель. Разработка и валидация методики количественного определения 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида (М1) и N-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида (М2) в плазме крови крысы и кролика методом ВЭЖХ-МС/МС.
Материалы и методы. Для пробоподготовки применялось осаждение белков метанолом. В качестве внутреннего стандарта использован 5-[2-(морфолин-4-карбонил)-1,3-оксазол-5-ил]-тиофен-2-сульфонамид. К пробам плазмы добавлялся 5%-й водный раствор аскорбиновой кислоты в объемном соотношении 1 : 2 для предотвращения разложения N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида. В качестве антикоагулянта выбрана комбинация натрия фторида и калия оксалата. Хроматографическое разделение проводили на колонке Zorbax Eclipse Plus C18 (150 × 3,0 мм, 3,5 мкм) с предколонкой Zorbax Eclipse Plus C18 (12,5 × 2,1 мм, 5,0 мкм) с применением подвижной фазы на основе 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты и метанола. Масс-спектрометрическое детектирование осуществляли в режиме MRM с использованием электрораспылительной ионизации в отрицательной полярности. Апробацию методики проводили во время фармакокинетического исследования 1%-й глазной суспензии 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида на 6 крысах линии Wistar. Образцы крови отбирали до введения, а также спустя 30 мин, 1 ч, 1ч 30 мин, 2 ч, 3 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч,144 ч, 216 ч после введения. Некомпартментный подход использовался для расчета фармакокинетических параметров.
Результаты и обсуждение. Разработанная методика прошла валидацию по показателям «селективность», «калибровочная кривая», «правильность и прецизионность», «эффект матрицы», «эффект разведения», «эффект переноса из предыдущей пробы», «воспроизводимость при повторном введении серии», «стабильность». Аналитический диапазон определения в плазме 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида составил 10–4000 нг/мл, М1 – 1,0–400,0 нг/мл, М2 – 0,1–40,0 нг/мл. Выбранная комбинация антикоагулянта и раствора стабилизатора позволяет хранить образцы плазмы в течение 28 дней в морозильной камере.
Заключение. Разработанная методика в ходе проведённой валидации подтвердила свою пригодность для количественного определения 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов в плазме крови лабораторных животных. Данная методика успешно использована при исследовании фармакокинетики 1%-й глазной суспензии изучаемого препарата.
Introduction. The study of the systemic exposure of a new original drug is an essential part of its preclinical study. 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide is a new selective carbonic anhydrase II inhibitor for the treatment of open-angle glaucoma. Methods for the quantitative determination of this compound and its N-hydroxy- and N-acetyl metabolites in the plasma of laboratory animals have not been previously developed.
Aim. Development and validation of a method of quantitative determination of 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide and its metabolites N-hydroxy-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide (M1) and N-acetyl-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide (M2) in rat and rabbit blood plasma by HPLC-MS/MS.
Materials and methods. Protein precipitation by methanol was applied for sample preparation. 5-[2-(morpholine-4-carbonyl)-1,3-oxazole-5-yl]-thiophene-2-sulfonamide was used as an internal standard. A 5 % aqueous solution of ascorbic acid was added to the plasma samples at volume ratio 1 : 2 to prevent decomposition of N-hydroxy-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide. The combination of sodium fluoride and potassium oxalate was selected as an anticoagulant. Chromatographic separation was performed on Zorbax Eclipse Plus C18 column (150 × 3.0 mm, 3.5 µm) with Zorbax Eclipse Plus C18 pre-column (12.5 × 2.1 mm, 5.0 µm) using a mobile phase based on a 0.1 % aqueous solution of formic acid and methanol. Mass spectrometric detection was carried out in the MRM mode using electrospray ionization in negative polarity. The method was tested during a pharmacokinetic study of a 1 % ocular suspension of 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide on 6 Wistar rats. Blood samples were collected before administration, as well as 30 min, 1 h, 1 h 30 min, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 144 h, 216 h after administration. The non-compartment approach was used for calculation pharmacokinetic parameters.
Results and discussion. The developed method has been validated in parameters of selectivity, calibration curve, accuracy and precision, matrix effect, dilution integrity, carry over, reinjection reproducibility, stability. The analytical range of determination of 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide in plasma was 10–4000 ng/ml, M1 – 1.0–400.0 ng/ml, M2 – 0.1–40.0 ng/ml. The selected combination of anticoagulant and stabilizer solution allows storage of plasma samples in freezing chamber for 28 days.
Conclusion. The developed method has been fully validated and confirmed its suitability for quantitative determination of 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide and its metabolites in the blood plasma of laboratory animals. The method has been successfully used for pharmacokinetic study of 1 % ocular suspension of the drug.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.