pharmjournalРазработка и регистрация лекарственных средствDrug development & registration2305-20662658-5049LLC «CPHA»10.33380/2305-2066-2025-14-1-1935pharmjournal-1999Research ArticleФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯPHARMACEUTICAL TECHNOLOGYОценка влияния поливинилпирролидон-винилацетата на свойства кверцетина в составе бинарной твердой дисперсии, полученной методом экструзии горячего расплаваAssessment of polyvinylpyrrolidone vinyl acetate effect on quercetin properties in binary solid dispersion prepared by hot melt extrussionhttps://orcid.org/0000-0002-0191-7342ДаниловаА. А.DanilovaA. A.

197022, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, литера А

14A, Prof. Popova str., Saint-Petersburg, 197022

shmarova.aleksandra@pharminnotech.comhttps://orcid.org/0000-0003-1922-3282ГусевК. А.GusevK. A.

197022, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, литера А

14A, Prof. Popova str., Saint-Petersburg, 197022

https://orcid.org/0009-0008-7730-9221АрхиповаН. О.ArkhipovaN. O.

197022, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, литера А

14A, Prof. Popova str., Saint-Petersburg, 197022

https://orcid.org/0000-0002-4479-3095ДаниловЛ. Г.DanilovL. G.

199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7–9

7–9, Universitetskaya Embankment, Saint-Petersburg, 199034

https://orcid.org/0000-0002-4716-7866ВишняковЕ. В.VishnyakovE. V.

197022, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, литера А

14A, Prof. Popova str., Saint-Petersburg, 197022

https://orcid.org/0000-0001-8070-1699МаймистовД. Н.MaimistovD. N.

197022, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, литера А

14A, Prof. Popova str., Saint-Petersburg, 197022

https://orcid.org/0000-0001-8077-2462ФлисюкЕ. В.FlisyukE. V.

197022, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, литера А

14A, Prof. Popova str., Saint-Petersburg, 197022

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России)Saint-Petersburg State Chemical and Pharmaceutical UniversityФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет» (СПбГУ), кафедра генетики и биотехнологийSt Petersburg University, Saint Petersburg State University (SPbU), Department of Genetics and Biotechnology202513122024141127137Copyright © Данилова А.А., Гусев К.А., Архипова Н.О., Данилов Л.Г., Вишняков Е.В., Маймистов Д.Н., Флисюк Е.В., 20252025Данилова А.А., Гусев К.А., Архипова Н.О., Данилов Л.Г., Вишняков Е.В., Маймистов Д.Н., Флисюк Е.В.Danilova A.A., Gusev K.A., Arkhipova N.O., Danilov L.G., Vishnyakov E.V., Maimistov D.N., Flisyuk E.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmjournal.ru/jour/article/view/1999Введение

Введение. Несмотря на выраженный терапевтический потенциал, флавоноиды ограниченно используются в медицинской практике в качестве активных фармацевтических субстанций (АФС) ввиду комплекса неудовлетворительных физико-химических свойств. Для изучения данной проблемы в качестве модельного объекта выбрана субстанция кверцетина, обладающая крайне низкой растворимостью в воде и средах желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). В связи с этим возникает интерес к исследованию возможности и перспектив применения подхода по улучшению физико-химических свойств флавоноидов на примере кверцетина с использованием технологии экструзии горячего расплава (ЭГР) для создания твердых дисперсных систем (ТДС) на основе гидрофильного полимера-носителя (поливинилпирролидон-винилацетата). Для улучшения свойств растворимости и растворения активного вещества обозначается необходимость подбора эффективного соотношения кверцетина и полимера в составе твердой дисперсии.

Цель

Цель. Оценка влияния поливинилпирролидон-винилацетата на свойства водной растворимости кверцетина в составе бинарной твердой дисперсии, полученной методом экструзии горячего расплава.

Материалы и методы

Материалы и методы. Объекты исследования: субстанция кверцетина (субстанция-порошок, содержание 98 %, Molekula Limited, Великобритания) и полимер-носитель в виде сополимера поливинилпирролидона с винилацетатом в соотношении 60 : 40 (ПВПВА) марки VIVAPHARM® PVP/VA 64 (JRS PHARMA GmbH & Co. KG, Германия). Получение ТДС кверцетина осуществляли с помощью двухшнекового лабораторного экструдера HAAKE™ MiniCTW (Thermo Fisher Scientific, Германия). Образцы исследовали методами фазово-контрастной микроскопии, ИК-Фурье-спектроскопии и дифференциальной сканирующей калориметрии. Количественное содержание кверцетина в составе твердой дисперсной системы определяли методом УФ-спектрофотометрии.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Независимо от концентрации ПВПВА в ТДС для всех составов отмечено улучшение свойств растворимости и скорости растворения кверцетина по сравнению с чистой субстанцией. Обнаружено, что по мере уменьшения содержания кверцетина увеличивается вклад полимера-носителя в ТДС, наблюдается частичная или даже полная аморфизация кверцетина в составах с 1%-м и 5%-м содержанием активного вещества, в результате чего улучшаются свойства водной растворимости, повышается стабильность растворов и скорость растворения образцов в средах желудочно-кишечного тракта. Водная растворимость кверцетина в составе 1%-й ТДС относительно исходной АФС увеличена в 353 раза. При этом в средах, моделирующих отделы ЖКТ, наблюдалось полное высвобождение кверцетина из 1%-й ТДС за 40 минут (для среды хлористоводородной кислоты и цитратного буфера) и растворение 90 % вещества в течение 60 минут в среде фосфатного буфера.

Заключение

Заключение. На основании проведенного исследования твердая дисперсия, содержащая 1 % кверцетина, на основе поливинилпирролидон-винилацетата является наиболее перспективной для дальнейшей разработки готовых лекарственных форм.

Introduction

Introduction. Flavonoids, despite their pronounced therapeutic benefits, are limitedly used in medicine as active pharmaceutical ingredients (API) owing to a complex of unsatisfactory physicochemical properties. In order to study the mentioned problem, we decided to use quercetin as model compound with extremely low water solubility and dissolution in gastrointestinal (GI) tract media. Therefore, the main idea appears to study the possibility and prospects of hot melt extrusion (HME) application for enhancement the solubility properties of quercetin in the composition of solid dispersion system (SDS) based on hydrophilic polymeric carrier (polyvinylpyrrolidone vinyl acetate, PVP/VA). Consequently, there is a necessity to select effective drug-to-polymer ratio in solid dispersion for providing better solubility and dissolution properties.

Aim

Aim. Assessment of PVP/VA effect on quercetin solubility properties in binary solid dispersion prepared by HME.

Materials and methods

Materials and methods. Quercetin substance with purity 98 % was purchased from Molekula Limited, United Kingdom. PVP/VA (copolymer of polyvinylpyrrolidone with vinyl acetate in the ratio of 60 : 40, VIVAPHARM® PVP/VA 64) as carrier was procured from JRS PHARMA (JRS PHARMA GmbH & Co. KG, Germany). Quercetin SDS were prepared using micro-conical twin screw compounder HAAKE™ MiniCTW (Thermo Fisher Scientific, Germany). The obtained samples were analyzed by phase-contrast microscopy, FTIR spectroscopy and differential scanning calorimetry (DSC). Quercetin quantitative content in SDS were determined by UV-spectrophotometry.

Results and discussion

Results and discussion. The improvement of water solubility and dissolution rates of quercetin SDS in comparison with pure substance was observed for all solid dispersion compositions irrespective to drug-to-polymer ratio. Notably, with reduction of quercetin content in SDS compositions the PVP/VA contribution was increased. We found partial or even complete amorphization of API in formulations with 1 % and 5 % quercetin content, resulting in the improvement of water solubility properties, stability of solutions and increased dissolution rates in GI tract media. Water solubility of 1 % SDS relative to pure substance was enhanced by 353-fold. At the same time, the complete release of quercetin from 1 % SDS was achieved in 40 minutes in the hydrochloric acid and citrate buffer, and also quercetin dissolution of 90 % in 60 minute was observed in phosphate buffer.

Conclusion

Conclusion. 1 % quercetin SDS based on PVP/VA appears to be the most promising for solid dosage forms development.

кверцетинтвердые дисперсииэкструзия горячего расплаваантипластификациярастворимостьрастворениеquercetinsolid dispersionshot melt extrusionantiplasticizationsolubilitydissolutionРабота выполнена на базе Центра коллективного пользования (ЦКП) «Аналитический центр ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России».The results of the work were obtained with equipment of the Center for Collective Use "Analytical Center of Saint-Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University".ReferencesLv H.-W., Wang Q.-L., Luo M., Zhu M.-D., Liang H.-M., Li W.-J., Cai H., Zhou Z.-B., Wang H., Tong S.-Q., Li X.-N. Phytochemistry and pharmacology of natural prenylated flavonoids. Archives of Pharmacal Research. 2023;46(4):207–272. DOI: 10.1007/s12272-023-01443-4.Lv H.-W., Wang Q.-L., Luo M., Zhu M.-D., Liang H.-M., Li W.-J., Cai H., Zhou Z.-B., Wang H., Tong S.-Q., Li X.-N. Phytochemistry and pharmacology of natural prenylated flavonoids. Archives of Pharmacal Research. 2023;46(4):207–272. DOI: 10.1007/s12272-023-01443-4.Wang X., Ma Y., Xu Q., Shikov A. N., Pozharitskaya O. N., Flisyuk E. V., Liu M., Li H., Vargas-Murga L., Duez P. Flavonoids and saponins: What have we got or missed? Phytomedicine. 2023;109:154580. DOI: 10.1016/j.phymed.2022.154580.Wang X., Ma Y., Xu Q., Shikov A. N., Pozharitskaya O. N., Flisyuk E. V., Liu M., Li H., Vargas-Murga L., Duez P. Flavonoids and saponins: What have we got or missed? Phytomedicine. 2023;109:154580. DOI: 10.1016/j.phymed.2022.154580.Russo C., Maugeri A., Musumeci L., De Sarro G., Cirmi S., Navarra M. Inflammation and Obesity: The Pharmacological Role of Flavonoids in the Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(3):2899. DOI: 10.3390/ijms24032899.Russo C., Maugeri A., Musumeci L., De Sarro G., Cirmi S., Navarra M. Inflammation and Obesity: The Pharmacological Role of Flavonoids in the Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(3):2899. DOI: 10.3390/ijms24032899.Pawar A., Russo M., Rani I., Goswami K., Russo G. L., Pal A. A critical evaluation of risk to reward ratio of quercetin supplementation for COVID-19 and associated comorbid conditions. Phytotherapy Research. 2022;36(6):2394–2415. DOI: 10.1002/ptr.7461.Pawar A., Russo M., Rani I., Goswami K., Russo G. L., Pal A. A critical evaluation of risk to reward ratio of quercetin supplementation for COVID-19 and associated comorbid conditions. Phytotherapy Research. 2022;36(6):2394–2415. DOI: 10.1002/ptr.7461.Степанова Э. Ф., Ремезова И. П., Шевченко А. М., Морозов А. В., Мальцева В. К. Флебопротекторы на базе флавоноидов: лекарственные формы, биофармацевтическая характеристика, технологические особенности. Фармация и фармакология. 2020;8(6):405–415. DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-6-405-415.Stepanova E. F., Remezova I. P., Shevchenko A. M., Morozov A. V., Maltseva V. K. Phleboprotectors based on flavonoids: dosage forms, biopharmaceutical characteristics, technological features. Pharmacy & Pharmacology. 2020;8(6):405–415. (In Russ.) DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-6-405-415.Liu X., Zhao L., Wu B., Chen F. Improving solubility of poorly water-soluble drugs by protein-based strategy: A review. International Journal of Pharmaceutics. 2023;634:122704. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2023.122704.Liu X., Zhao L., Wu B., Chen F. Improving solubility of poorly water-soluble drugs by protein-based strategy: A review. International Journal of Pharmaceutics. 2023;634:122704. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2023.122704.Данилова А. А., Гусев К. А., Маймистов Д. Н., Флисюк Е. В. Технология экструзии горячего расплава как современная стратегия улучшения биодоступности флавоноидов. Химико-фармацевтический журнал. 2024;58(2):26–35. DOI 10.30906/0023-1134-2024-58-2-26-35.Danilova A. A., Gusev K. A., Maimistov D. N., Flisyuk E. V. Hot Melt Extrusion Technology as a Modern Strategy for Improving the Bioavailability of Flavonoids. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2024;58(2):26–35. (In Russ.) DOI: 10.30906/0023-1134-2024-58-2-26-35Berga M., Logviss K., Lauberte L., Paulausks A., Mohylyuk V. Flavonoids in the Spotlight: Bridging the Gap between Physicochemical Properties and Formulation Strategies. Pharmaceuticals. 2023;16(10):1407. DOI: 10.3390/ph16101407.Berga M., Logviss K., Lauberte L., Paulausks A., Mohylyuk V. Flavonoids in the Spotlight: Bridging the Gap between Physicochemical Properties and Formulation Strategies. Pharmaceuticals. 2023;16(10):1407. DOI: 10.3390/ph16101407.Гусев К. А., Маймистов Д. Н., Павловский В. И., Алиев А. Р., Павловский А. В., Иванова О. В., Цыренов Д. О., Флисюк Е. В. Разработка состава и технологии получения твердой дисперсной системы методом экструзии горячего расплава для повышения биодоступности действующего вещества. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(4):108–115. DOI: 10.33380/2305-2066-2022-11-4-108-115.Gusev K. A., Maimistov D. N., Pavlovsky V. I., Aliev A. R., Pavlovsky A. V., Ivanova O. V., Tsyrenov D. O., Flisyuk E. V. Development of the Composition and Technology for Production a Solid Dispersion System by Hot Melt Extrusion to Increase the Bioavailability of the Active Substance. Drug development & registration. 2022;11(4):108–115. (In Russ.) DOI: 10.33380/2305-2066-2022-11-4-108-115.Гусев К. А., Алиев А. Р., Генералова Ю. Э., Аксенова Н. А., Речкалов Г. В., Маймистов Д. Н., Алексеева Г. М., Флисюк Е. В. Разработка состава и технологии получения аморфной твердой дисперсной системы эбастина методом экструзии горячего расплава для увеличения скорости растворения. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2023;12(4):126–135. DOI: 10.33380/2305-2066-2023-12-4-1577.Gusev K. A., Aliev A. R., Generalova Yu. E., Aksenova N. A., Rechkalov G. V., Maimistov D. N., Alekseeva G. M., Flisyuk E. V. Composition and Technology Development for Obtaining Amorphous Solid Dispersion of Ebastine by Hot Melt Extrusion to Increase Dissolution Rate. Drug development & registration. 2023;12(4):126–135. (In Russ.) DOI: 10.33380/2305-2066-2023-12-4-1577.Tong M., Wu X., Zhang S., Hua D., Li S., Yu X., Wang J., Zhang Z. Application of TPGS as an efflux inhibitor and a plasticizer in baicalein solid dispersion. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2022;168:106071. DOI: 10.1016/j.ejps.2021.106071.Tong M., Wu X., Zhang S., Hua D., Li S., Yu X., Wang J., Zhang Z. Application of TPGS as an efflux inhibitor and a plasticizer in baicalein solid dispersion. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2022;168:106071. DOI: 10.1016/j.ejps.2021.106071.Khor C. M., Ng W. K., Kanaujia P., Chan K. P., Dong Y. Hot-melt extrusion microencapsulation of quercetin for taste-masking. Journal of Microencapsulation. 2017;34(1):29–37. DOI: 10.1080/02652048.2017.1280095.Khor C. M., Ng W. K., Kanaujia P., Chan K. P., Dong Y. Hot-melt extrusion microencapsulation of quercetin for taste-masking. Journal of Microencapsulation. 2017;34(1):29–37. DOI: 10.1080/02652048.2017.1280095.Ishimoto K., Shimada Y., Ohno A., Otani S., Ago Y., Maeda S., Lin B., Nunomura K., Hino N., Suzuki M., Nakagawa S. Physicochemical and biochemical evaluation of amorphous solid dispersion of naringenin prepared using hot-melt extrusion. Frontiers in Nutrition. 2022;9:850103. DOI: 10.3389/fnut.2022.850103.Ishimoto K., Shimada Y., Ohno A., Otani S., Ago Y., Maeda S., Lin B., Nunomura K., Hino N., Suzuki M., Nakagawa S. Physicochemical and biochemical evaluation of amorphous solid dispersion of naringenin prepared using hot-melt extrusion. Frontiers in Nutrition. 2022;9:850103. DOI: 10.3389/fnut.2022.850103.Truzzi F., Tibaldi C., Zhang Y., Dinelli G., D'Amen E. An overview on dietary polyphenols and their biopharmaceutical classification system (BCS). International Journal of Molecular Sciences. 2021;22(11):5514. DOI: 10.3390/ijms22115514.Truzzi F., Tibaldi C., Zhang Y., Dinelli G., D'Amen E. An overview on dietary polyphenols and their biopharmaceutical classification system (BCS). International Journal of Molecular Sciences. 2021;22(11):5514. DOI: 10.3390/ijms22115514.Golonka I., Wilk S., Musiał W. The influence of UV radiation on the degradation of pharmaceutical formulations containing quercetin. Molecules. 2020;25(22):5454. DOI: 10.3390/molecules25225454.Golonka I., Wilk S., Musiał W. The influence of UV radiation on the degradation of pharmaceutical formulations containing quercetin. Molecules. 2020;25(22):5454. DOI: 10.3390/molecules25225454.Mathers A., Pechar M., Hassouna F., Fulem M. API solubility in semi-crystalline polymer: Kinetic and thermodynamic phase behavior of PVA-based solid dispersions. International Journal of Pharmaceutics. 2022;623:121855. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2022.121855.Mathers A., Pechar M., Hassouna F., Fulem M. API solubility in semi-crystalline polymer: Kinetic and thermodynamic phase behavior of PVA-based solid dispersions. International Journal of Pharmaceutics. 2022;623:121855. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2022.121855.Rosiak N., Wdowiak K., Tykarska E., Cielecka-Piontek J. Amorphous solid dispersion of hesperidin with polymer excipients for enhanced apparent solubility as a more effective approach to the treatment of civilization diseases. International Journal of Molecular Sciences. 2022;23(23):15198. DOI: 10.3390/ijms232315198.Rosiak N., Wdowiak K., Tykarska E., Cielecka-Piontek J. Amorphous solid dispersion of hesperidin with polymer excipients for enhanced apparent solubility as a more effective approach to the treatment of civilization diseases. International Journal of Molecular Sciences. 2022;23(23):15198. DOI: 10.3390/ijms232315198.Dengale S. J., Hussen S. S., Krishna B. S. M., Musmade P. B., Gautham Shenoy G., Bhat K. Fabrication, solid state characterization and bioavailability assessment of stable binary amorphous phases of Ritonavir with Quercetin. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2015;89:329–338. DOI: 10.1016/j.ejpb.2014.12.025.Dengale S. J., Hussen S. S., Krishna B. S. M., Musmade P. B., Gautham Shenoy G., Bhat K. Fabrication, solid state characterization and bioavailability assessment of stable binary amorphous phases of Ritonavir with Quercetin. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2015;89:329–338. DOI: 10.1016/j.ejpb.2014.12.025.Garbiec E., Rosiak N., Zalewski P., Tajber L., Cielecka-Piontek J. Genistein co-amorphous systems with amino acids: An investigation into enhanced solubility and biological activity. Pharmaceutics. 2023;15(12):2653. DOI: 10.3390/pharmaceutics15122653.Garbiec E., Rosiak N., Zalewski P., Tajber L., Cielecka-Piontek J. Genistein co-amorphous systems with amino acids: An investigation into enhanced solubility and biological activity. Pharmaceutics. 2023;15(12):2653. DOI: 10.3390/pharmaceutics15122653.Wdowiak K., Tajber L., Miklaszewski A., Cielecka-Piontek J. Sweeteners Show a Plasticizing Effect on PVP K30—A Solution for the Hot-Melt Extrusion of Fixed-Dose Amorphous Curcumin-Hesperetin Solid Dispersions. Pharmaceutics. 2024;16(5):659. DOI: 10.3390/pharmaceutics16050659.Wdowiak K., Tajber L., Miklaszewski A., Cielecka-Piontek J. Sweeteners Show a Plasticizing Effect on PVP K30—A Solution for the Hot-Melt Extrusion of Fixed-Dose Amorphous Curcumin-Hesperetin Solid Dispersions. Pharmaceutics. 2024;16(5):659. DOI: 10.3390/pharmaceutics16050659.Gordon M., Taylor J. S. Ideal copolymers and the second-order transitions of synthetic rubbers. i. non-crystal-line copolymers. Journal of Applied Chemistry. 1952;493–500. DOI: 10.1002/jctb.5010020901.Gordon M., Taylor J. S. Ideal copolymers and the second-order transitions of synthetic rubbers. i. non-crystal-line copolymers. Journal of Applied Chemistry. 1952;493–500. DOI: 10.1002/jctb.5010020901.Letinski D. J., Redman A. D., Birch H., Mayer P. Inter-laboratory comparison of water solubility methods applied to difficult-to-test substances. BMC Chemistry. 2021;15:52. DOI: 10.1186/s13065-021-00778-7.Letinski D. J., Redman A. D., Birch H., Mayer P. Inter-laboratory comparison of water solubility methods applied to difficult-to-test substances. BMC Chemistry. 2021;15:52. DOI: 10.1186/s13065-021-00778-7.Kapourani A., Vardaka E., Katopodis K., Kachrimanis K., Barmpalexis P. Crystallization tendency of APIs possessing different thermal and glass related properties in amorphous solid dispersions. International Journal of Pharmaceutics. 2020;579:119149. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2020.119149.Kapourani A., Vardaka E., Katopodis K., Kachrimanis K., Barmpalexis P. Crystallization tendency of APIs possessing different thermal and glass related properties in amorphous solid dispersions. International Journal of Pharmaceutics. 2020;579:119149. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2020.119149.Browne E., Worku Z. A., Healy A. M. Physicochemical properties of poly-vinyl polymers and their influence on ketoprofen amorphous solid dispersion performance: a polymer selection case study. Pharmaceutics. 2020;12(5):433. DOI: 10.3390/pharmaceutics12050433.Browne E., Worku Z. A., Healy A. M. Physicochemical properties of poly-vinyl polymers and their influence on ketoprofen amorphous solid dispersion performance: a polymer selection case study. Pharmaceutics. 2020;12(5):433. DOI: 10.3390/pharmaceutics12050433.Kandemir K., Tomas M., McClements D. J., Capanoglu E. Recent advances on the improvement of quercetin bioavailability. Trends in Food Science & Technology. 2022;119:192–200. DOI: 10.1016/j.tifs.2021.11.032.Kandemir K., Tomas M., McClements D. J., Capanoglu E. Recent advances on the improvement of quercetin bioavailability. Trends in Food Science & Technology. 2022;119:192–200. DOI: 10.1016/j.tifs.2021.11.032.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.