pharmjournalРазработка и регистрация лекарственных средствDrug development & registration2305-20662658-5049LLC «CPHA»10.33380/2305-2066-2025-14-4-2043pharmjournal-2182Research ArticleМЕТОДЫ АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВANALYTICAL METHODSРазработка методик контроля качества химического предшественника – рекомбинантного белка с анкириновыми повторами для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2 в злокачественных опухоляхDevelopment of quality control techniques of chemical precursor – recombinant protein with ankyrin repeats for radionuclide imaging of HER2 overexpression in malignant tumorshttps://orcid.org/0009-0002-4282-3198ВарвашеняР. Н.VarvashenyaR. N.

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2; 634050, г. Томск, проспект Ленина, д. 30

2, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050; 30, prospekt Lenina, Tomsk, 634050

mr.varvashenya@mail.ruhttps://orcid.org/0009-0006-0383-3296ЯновичГ. Е.YanovichG. E.

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2; 634050, г. Томск, проспект Ленина, д. 30

2, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050; 30, prospekt Lenina, Tomsk, 634050

https://orcid.org/0000-0002-4374-6422ПлотниковЕ. В.PlotnikovE. V.

634050, г. Томск, проспект Ленина, д. 30

30, prospekt Lenina, Tomsk, 634050

https://orcid.org/0000-0003-3425-0828ШульгаА. А.ShulgaA. A.

634050, г. Томск, проспект Ленина, д. 30; 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10

30, prospekt Lenina, Tomsk, 634050; 16/10, Miklukho-Maklaya str., Moscow, 117997

https://orcid.org/0000-0002-4187-376XКоноваловаЕ. В.KonovalovaE. V.

634050, г. Томск, проспект Ленина, д. 30; 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10

30, prospekt Lenina, Tomsk, 634050; 16/10, Miklukho-Maklaya str., Moscow, 117997

https://orcid.org/0000-0002-7931-519XЗиганшинР. Х.ZigashinR. H.

117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10

16/10, Miklukho-Maklaya str., Moscow, 117997

https://orcid.org/0000-0002-3952-0631ДеевС. М.DeevS. M.

634050, г. Томск, проспект Ленина, д. 30; 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10

30, prospekt Lenina, Tomsk, 634050; 16/10, Miklukho-Maklaya str., Moscow, 117997

https://orcid.org/0000-0002-4779-9820БразовскийК. С.BrazovskiiK. S.

634050, г. Томск, проспект Ленина, д. 30

30, prospekt Lenina, Tomsk, 634050

https://orcid.org/0000-0002-2153-7945БелоусовМ. В.BelousovM. V.

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2; 634050, г. Томск, проспект Ленина, д. 30

2, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050; 30, prospekt Lenina, Tomsk, 634050

https://orcid.org/0000-0001-8753-7916ЧерновВ. И.ChernovV. I.

634050, г. Томск, проспект Ленина, д. 30; 634009, г. Томск, Кооперативный переулок, д. 5

30, prospekt Lenina, Tomsk, 634050; 5, Kooperativny pereulok, Tomsk, 634009

https://orcid.org/0000-0003-1176-2441ЛарькинаМ. С.LarkinaM. S.

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2; 634050, г. Томск, проспект Ленина, д. 30

2, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050; 30, prospekt Lenina, Tomsk, 634050

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России); Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» (НИ ТПУ)РоссияSiberian State Medical University, SSMU; National Research Tomsk Polytechnic University, Tomsk Polytechnic University (TPU)Russian FederationФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» (НИ ТПУ)РоссияNational Research Tomsk Polytechnic University, Tomsk Polytechnic University (TPU)Russian FederationФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» (НИ ТПУ); Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН)РоссияNational Research Tomsk Polytechnic University, Tomsk Polytechnic University (TPU); Shemyakin-Ovchinnikov Institute of bioorganic chemistryRussian FederationФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН)РоссияShemyakin-Ovchinnikov Institute of bioorganic chemistryRussian FederationФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» (НИ ТПУ); Научно-исследовательский институт онкологии – филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук» (НИИ онкологии Томского НИМЦ)РоссияNational Research Tomsk Polytechnic University, Tomsk Polytechnic University (TPU); Cancer Research Institute is a subdivision of the Federal State Budgetary Scientific Institution "Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences" (Tomsk NRMC)Russian Federation202503122025144138151Copyright © Варвашеня Р.Н., Янович Г.Е., Плотников Е.В., Шульга А.А., Коновалова Е.В., Зиганшин Р.Х., Деев С.М., Бразовский К.С., Белоусов М.В., Чернов В.И., Ларькина М.С., 20252025Варвашеня Р.Н., Янович Г.Е., Плотников Е.В., Шульга А.А., Коновалова Е.В., Зиганшин Р.Х., Деев С.М., Бразовский К.С., Белоусов М.В., Чернов В.И., Ларькина М.С.Varvashenya R.N., Yanovich G.E., Plotnikov E.V., Shulga A.A., Konovalova E.V., Zigashin R.H., Deev S.M., Brazovskii K.S., Belousov M.V., Chernov V.I., Larkina M.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmjournal.ru/jour/article/view/2182Введение

Введение. Сверхэкспрессия рецептора HER2 ассоциирована с агрессивным течением онкологических заболеваний и неблагоприятным прогнозом. Традиционная иммуногистохимическая диагностика имеет ряд ограничений, включая инвазивность, невозможность оценки гетерогенности опухоли и тотального распространения процесса. Перспективной альтернативой является радионуклидная визуализация с использованием каркасных таргетных белков DARPin G3. По результатам доклинических исследований препарат 99mTс[Tc]-G3-(G3S)3C был предложен для проведения I фазы клинических исследований. Экспериментальный препарат представляет собой стерильный лиофилизат химического предшественника в одном флаконе и должен соответствовать требованиям ОФС 1.11.0005 «Химические предшественники для радиофармацевтических лекарственных препаратов» и ОФС 1.7.1.0007.15 «Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК» Государственной фармакопеи РФ XV издания.

Цель

Цель. Целью настоящего исследования была разработка подходов и методик контроля качества белка DARPin G3-(G3S)3C, входящего в состав разработанной композиции лиофилизата химических предшественников для получения 99mTс-содержащего препарата для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2 в злокачественных опухолях

Материалы и методы

Материалы и методы. Объектом исследования явился лиофилизат, содержащий DARPin G3-(G3S)3C со вспомогательными веществами. Для регистрации масс-спектров белка использовали ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометром, снабженным источником ионизации электрораспылением. Вертикальный электрофорез с натрия додецилсульфатом (SDS) в полиакриламидном геле с концентрацией акриламида 15 % проводили при напряжении 110 В в течение 2 ч. В качестве красящего раствора использовали раствор кумасси В-250. Тандемную масс-спектрометрию проводили с помощью системы ВЭЖХ с масс-спектрометром посредством наноэлектроспрейного источника. При корреляции аминокислотной последовательности карбамидометилирование Cys, деамидирование Asn/Gln и окисление Met учитывались как вариабельные модификации. Для определения количества белка в лиофилизате был использован спектрофотометрический метод при длине волны 280 нм. Валидационная оценка разработанной методики проводилась в соответствии с требованиями ОФС.1.1.0012 «Валидация аналитических методик» Государственной фармакопеи РФ XV издания.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Подлинность и чистота DARPin G3-(G3S)3C была подтверждена с использованием ВЭЖХ-МС. Молекулярная масса мономера согласуется с расчетной и составила 14075,9 Да с точностью до 0,5 Да, чистота белка была близка к 100 %. Для определения подлинности и чистоты DARPin G3-(G3S)3C методом электрофореза в полиакриаламидном геле предложено использовать 2 мкг и 20 мкг белка соответственно. Рассчитанная молекулярная масса белка составила 13,58 ± 0,82 кДа. В лиофилизате содержание примеси гомодимера, определенной электрофорезом в полиакриламидном геле, не превышало 3 %, другие белковые примеси наблюдались в количестве не более 1 %. Чистота белка, установленная методом ВЭЖХ-МС/МС для анализа первичной структуры, составила 98 %. Перекрытие аминокислотной последовательности целевого белка с идентифицированными пептидными фрагментами составило 100 %. В результате анализа гидролизата белка было идентифицировано более 700 его пептидных фрагментов (значение –10LоgP – более 20). Разработанная методика УФ-спектрофотомерии соответствует валидационным требованиям и позволяет определять количественного содержание белка DARPin G3-(G3S)3C в лиофилизате ±10 % от номинального содержания.

Заключение

Заключение. Для определения показателя «подлинность» нового химического предшественника белка DARPin G3-(G3S)3C в составе лиофилизата для получения  99mTс-содержащего препарата для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2 в злокачественных опухолях были предложены методики масс-спектрометрии, пептидного картирования, электрофорез в полиакриламидном геле. Для показателя «родственные примеси» – методика электрофореза в полиакриламидном геле. Для определения показателя «количественное определение» – методика УФ-спектрофотометрии.

Introduction

Introduction. Overexpression of the HER2 receptor is associated with aggressive cancer progression and poor prognosis. Traditional immunohistochemical diagnostics have a number of limitations, including invasiveness, inability to assess tumor heterogeneity, and total spread of the process. A promising alternative is radionuclide imaging using targeted scaffold DARPin G3 proteins. Based on the results of preclinical studies, the drug 99mTc[Tc]-G3-(G3S)3C has been proposed for Phase I clinical trials. The experimental drug is a sterile lyophilizate of a chemical precursor in a single vial and must comply with the requirements of OFS 1.11.0005 "Chemical Precursors for Radiopharmaceuticals" and OFS 1.7.1.0007.15 "Medicinal Products Obtained by Recombinant DNA Methods."

Aim

Aim. The aim of the present study was to develop approaches and techniques for quality control of DARPin G3-(G3S)3C protein included in the developed composition of chemical precursor lyophilizate lyophilizate for preparation of 99mTc-containing preparation for radionuclide imaging of HER2 overexpression in malignant tumors

Materials and methods

Materials and methods. A lyophilizate containing DARPin G3-(G3S)3C with excipients was prepared for quality control. HPLC with a tandem mass spectrometer equipped with an electrospray ionization source was used to record mass spectra. Vertical electrophoresis with SDS in a heterogeneous buffer system was carried out in a polyacrylamide gel with an acrylamide concentration of 15 % at 110 V for 2 hours. Coomassie B-250 solution was used as the dye solution. Peptide mapping was performed using an HPLC system with a mass spectrometer via a nano-electrospray source. When correlating the amino acid sequence, carbamidomethylation of Cys, deamidation of Asn/Gln and oxidation of Met were counted as variable modifications. UV spectrophotometry was performed to determine the Quantification index at a wavelength of 280 nm. Validation evaluation of the developed method was carried out in accordance with the requirements of OFS.1.1.0012 "Validation of analytical methods".

Results and discussion

Results and discussion. The authenticity and purity of DARPin G3-(G3S)3C was confirmed using HPLC-MS. The purity of the protein was close to 100 %. Application of 2 μg of protein for electrophoresis in polyacrylamide gel showed a distinct stain allowing the authenticity of DARPin G3-(G3S)3C to be established. To determine the homodimer impurity, 10 μg of protein should be applied. The purity of the protein established by the peptide mapping method is 98 %. More than 700 variations of peptide fragments were identified by protein hydrolysate analysis. The value of –10LogP was more than 20. The developed UV-visible spectrophotometry technique meets the validation requirements and allows the quantification of DARPin G3-(G3S)3C protein in the lyophilizer ±10 % of the nominal content.

Conclusion

Conclusion. To determine the "Genuineness" of a new chemical precursor of DARPin G3-(G3S)3C protein in the lyophilizate for the preparation of 99mTc-containing preparation for radionuclide imaging of HER2 overexpression in malignant tumors the following methods were proposed: mass spectrometry, peptide mapping, electrophoresis in polyacrylamide gel. For the indicator "Related impurities" – the technique of electrophoresis in polyacrylamide gel. For the indicator "Quantitative determination" the method of UV-spectrophotometry.

злокачественные опухолиHER2радионуклидная диагностикаDARPin G3контроль качестваmalignant tumorsHER2radionuclide diagnosticsDARPin G3quality controlРабота была выполнена за счет финансирования проекта ТПУ (Приоритет-2030-НИП/ИЗ-104-375/423-2023).The work was carried out using funding from the the National Research Tomsk Polytechnic University project (Priority-2030-NIP/IZ-104-375/423-2023).ReferencesBartley A. N., Washington M. K., Ventura C. B., Ismaila N., Colasacco C., Benson A. B., Carrato A., Gulley M. L., Jain D., Kakar S., Mackay H. J., Streutker C., Tang L., Troxell M., Ajani J. A. HER2 Testing and Clinical Decision Making in Gastroesophageal Adenocarcinoma: Guideline From the College of American Pathologists, American Society for Clinical Pathology, and American Society of Clinical Oncology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2016;140(12):1345–1363. DOI: 10.5858/arpa.2016-0331-CP.Bartley A. N., Washington M. K., Ventura C. B., Ismaila N., Colasacco C., Benson A. B., Carrato A., Gulley M. L., Jain D., Kakar S., Mackay H. J., Streutker C., Tang L., Troxell M., Ajani J. A. HER2 Testing and Clinical Decision Making in Gastroesophageal Adenocarcinoma: Guideline From the College of American Pathologists, American Society for Clinical Pathology, and American Society of Clinical Oncology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2016;140(12):1345–1363. DOI: 10.5858/arpa.2016-0331-CP.Gebhart G., Lamberts L. E., Wimana Z., Garcia C, Emonts P., Ameye L., Stroobants S., Huizing M., Aftimos P., Tol J., Oyen W. J. G., Vugts D. J., Hoekstra O. S., Schröder C. P., Menke-van der Houven van Oordt C. W., Guiot T., Brouwers A. H., Awada A., de Vries E. G. E., Flamen P. Molecular imaging as a tool to investigate heterogeneity of advanced HER2-positive breast cancer and to predict patient outcome under trastuzumab emtansine (T-DM1): the ZEPHIR trial. Annals of oncology. 2016;27(4):619–624. DOI: 10.1093/annonc/mdv577.Gebhart G., Lamberts L. E., Wimana Z., Garcia C, Emonts P., Ameye L., Stroobants S., Huizing M., Aftimos P., Tol J., Oyen W. J. G., Vugts D. J., Hoekstra O. S., Schröder C. P., Menke-van der Houven van Oordt C. W., Guiot T., Brouwers A. H., Awada A., de Vries E. G. E., Flamen P. Molecular imaging as a tool to investigate heterogeneity of advanced HER2-positive breast cancer and to predict patient outcome under trastuzumab emtansine (T-DM1): the ZEPHIR trial. Annals of oncology. 2016;27(4):619–624. DOI: 10.1093/annonc/mdv577.Tolmachev V. Imaging of HER-2 overexpression in tumors for guiding therapy. Current Pharmaceutical Design. 2008;14(28):2999–3019. DOI: 10.2174/138161208786404290.Tolmachev V. Imaging of HER-2 overexpression in tumors for guiding therapy. Current Pharmaceutical Design. 2008;14(28):2999–3019. DOI: 10.2174/138161208786404290.Wolff A. C., Somerfield M. R., Dowsett M., Hammond M. E. H., Hayes D. F., McShane L. M., Saphner T. J., Spears P. A., Allison K. H. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer: ASCO-College of American Pathologists Guideline Update. Journal of Clinical Oncology. 2023;41(22):3867–3872. DOI: 10.1200/jco.22.02864.Wolff A. C., Somerfield M. R., Dowsett M., Hammond M. E. H., Hayes D. F., McShane L. M., Saphner T. J., Spears P. A., Allison K. H. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer: ASCO-College of American Pathologists Guideline Update. Journal of Clinical Oncology. 2023;41(22):3867–3872. DOI: 10.1200/jco.22.02864.Azhar A., Ahmad E., Zia Q., Rauf M. A., Owais M., Ashraf G. M. Recent advances in the development of novel protein scaffolds based therapeutics. International Journal of Biological Macromolecules. 2017;102:630–641. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2017.04.045.Azhar A., Ahmad E., Zia Q., Rauf M. A., Owais M., Ashraf G. M. Recent advances in the development of novel protein scaffolds based therapeutics. International Journal of Biological Macromolecules. 2017;102:630–641. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2017.04.045.Sörensen J., Velikyan I., Sandberg D., Wennborg A., Feldwisch J., Tolmachev V., Orlova A., Sandström M., Lubberink M., Olofsson H. Measuring HER2-receptor expression in metastatic breast cancer using [68Ga] ABY-025 Affibody PET/CT. Theranostics. 2016;6(2):262.Sörensen J., Velikyan I., Sandberg D., Wennborg A., Feldwisch J., Tolmachev V., Orlova A., Sandström M., Lubberink M., Olofsson H. Measuring HER2-receptor expression in metastatic breast cancer using [68Ga] ABY-025 Affibody PET/CT. Theranostics. 2016;6(2):262.Skuridin V. S., Stasyuk E. S., Bragina O. D., Yusubov M. S., Chernov V. I., Larkina M. S., Zelchan R. V., Rogov A., Sinilkin I., Larionova L. Development of radiopharmaceutical based on mini-antibody for early cancer detection. Annual Congress of the European-Association-of-Nuclear-Medicine. 2016;43:465–465.Skuridin V. S., Stasyuk E. S., Bragina O. D., Yusubov M. S., Chernov V. I., Larkina M. S., Zelchan R. V., Rogov A., Sinilkin I., Larionova L. Development of radiopharmaceutical based on mini-antibody for early cancer detection. Annual Congress of the European-Association-of-Nuclear-Medicine. 2016;43:465–465.Брагина О. Д., Ларькина М. С., Стасюк Е. С., Чернов В. И., Юсубов М. С., Скуридин В. С., Деев С. М., Зельчан Р. В., Булдаков М. А., Подрезова Е. В., Белоусов М. В. Разработка высокоспецифичного радиохимического соединения на основе меченых <sup>99m</sup>Тс рекомбинантных адресных молекул для визуализации клеток с гиперэкспрессией Her-2/neu. Бюллетень сибирской медицины. 2017;16(3):25–33. DOI: 10.20538/1682-0363-2017-3-25-33.Bragina O. D., Larkina M. S., Stasyuk E. S., Chernov V. I., Yusubov M. S., Skuridin V. S., Deyev S. M., Zel’chan R. V., Buldakov M. A., Podrezova E. V., Belousov M. V. The development of a highly specific radiochemical compound based on labeled <sup>99m</sup>Тс recombinant molecules for targeted imaging of cells with the overexpression of Her-2/neu. Bulletin of Siberian Medicine. 2017;16(3):25–33. (In Russ.) DOI: 10.20538/1682-0363-2017-3-25-33.Брагина О. Д., Чернов В. И., Зельчан Р. В., Синилкин И. Г., Медведева А. А., Ларькина М. С. Альтернативные каркасные белки в радионуклидной диагностике злокачественных образований. Бюллетень сибирской медицины. 2019;18(3):125–133. DOI: 10.20538/1682-0363-2019-3-125-133.Bragina O. D., Chernov V. I., Zeltchan R. V., Sinilkin I. G., Medvedeva A. A., Larkina M. S. Alternative scaffolds in radionuclide diagnosis of malignancies. Bulletin of Siberian Medicine. 2019;18(3):125–133. (In Russ.) DOI: 10.20538/1682-0363-2019-3-125-133Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annual review of pharmacology and toxicology. 2015;55:489–511.Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annual review of pharmacology and toxicology. 2015;55:489–511.Deyev S. M., Xu T., Liu Y., Schulga A., Konovalova E., Garousi J., Rinne S. S., Larkina M., Ding H., Gräslund T., Orlova A., Tolmachev V., Vorobyeva A. Influence of the Position and Composition of Radiometals and Radioiodine Labels on Imaging of Epcam Expression in Prostate Cancer Model Using the DARPin Ec1. Cancers. 2021;13(14):3589. DOI: 10.3390/cancers13143589.Deyev S. M., Xu T., Liu Y., Schulga A., Konovalova E., Garousi J., Rinne S. S., Larkina M., Ding H., Gräslund T., Orlova A., Tolmachev V., Vorobyeva A. Influence of the Position and Composition of Radiometals and Radioiodine Labels on Imaging of Epcam Expression in Prostate Cancer Model Using the DARPin Ec1. Cancers. 2021;13(14):3589. DOI: 10.3390/cancers13143589.Zelchan R., Chernov V., Medvedeva A., Rybina A., Bragina O., Mishina E., Larkina M., Varvashenya R., Fominykh A., Schulga A., Konovalova E., Vorobyeva A., Orlova A., Tashireva L., Deyev S. M., Tolmachev V. Phase I Clinical Evaluation of Designed Ankyrin Repeat Protein [<sup>99m</sup>Tc]Tc(CO)<sub>3</sub>-(HE)<sub>3</sub>-Ec1 for Visualization of EpCAM-Expressing Lung Cancer. Cancers. 2024;16(16):2815. DOI: 10.3390/cancers16162815.Zelchan R., Chernov V., Medvedeva A., Rybina A., Bragina O., Mishina E., Larkina M., Varvashenya R., Fominykh A., Schulga A., Konovalova E., Vorobyeva A., Orlova A., Tashireva L., Deyev S. M., Tolmachev V. Phase I Clinical Evaluation of Designed Ankyrin Repeat Protein [<sup>99m</sup>Tc]Tc(CO<sub>3</sub>-(HE)<sub>3</sub>-Ec1 for Visualization of EpCAM-Expressing Lung Cancer. Cancers. 2024;16(16):2815. DOI: 10.3390/cancers16162815.Kobe B, Kajava A.V. When protein folding is simplified to protein coiling: the continuum of solenoid protein structures. Trends in Biochemical Sciences. 2000;25(10):509–515. DOI: 10.1016/s0968-0004(00)01667-4.Kobe B, Kajava A.V. When protein folding is simplified to protein coiling: the continuum of solenoid protein structures. Trends in Biochemical Sciences. 2000;25(10):509–515. DOI: 10.1016/s0968-0004(00)01667-4.Binz H. K., Stumpp M. T., Forrer P., Amstutz P., Plückthun A. Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins. Journal of Molecular Biology. 2003;332(2):489–503. DOI: 10.1016/s0022-2836(03)00896-9.Binz H. K., Stumpp M. T., Forrer P., Amstutz P., Plückthun A. Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins. Journal of Molecular Biology. 2003;332(2):489–503. DOI: 10.1016/s0022-2836(03)00896-9.Goldstein R., Sosabowski J., Livanos M., Leyton J., Vigor K., Bhavsar G., Nagy-Davidescu G., Rashid M., Miranda E., Yeung J., Tolner B., Plückthun A., Mather S., Meyer T., Chester K. Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular imaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 2015;42(2):288–301. DOI: 10.1007/s00259-014-2940-2.Goldstein R., Sosabowski J., Livanos M., Leyton J., Vigor K., Bhavsar G., Nagy-Davidescu G., Rashid M., Miranda E., Yeung J., Tolner B., Plückthun A., Mather S., Meyer T., Chester K. Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular imaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 2015;42(2):288–301. DOI: 10.1007/s00259-014-2940-2.Vorobyeva A., Schulga A., Konovalova E., Güler R., Löfblom J., Sandström M., Garousi J., Chernov V., Bragina O., Orlova A. Optimal composition and position of histidine-containing tags improves biodistribution of 99mTc-labeled DARPin G3. Scientific Reports. 2019;9(1):9405.Vorobyeva A., Schulga A., Konovalova E., Güler R., Löfblom J., Sandström M., Garousi J., Chernov V., Bragina O., Orlova A. Optimal composition and position of histidine-containing tags improves biodistribution of 99mTc-labeled DARPin G3. Scientific Reports. 2019;9(1):9405.Bragina O., Chernov V., Schulga A., Konovalova E., Garbukov E., Vorobyeva A., Orlova A., Tashireva L., Sörensen J., Zelchan R., Medvedeva A., Deyev S., Tolmachev V. Phase I Trial of <sup>99m</sup>Тс-(HE)<sub>3</sub>-G3, a DARPin-Based Probe for Imaging of HER2 Expression in Breast Cancer. Journal of Nuclear Medicine. 2022;63(4):528–535. DOI: 10.2967/jnumed.121.262542.Bragina O., Chernov V., Schulga A., Konovalova E., Garbukov E., Vorobyeva A., Orlova A., Tashireva L., Sörensen J., Zelchan R., Medvedeva A., Deyev S., Tolmachev V. Phase I Trial of <sup>99m</sup>Tc-(HE)<sub>3</sub>-G3, a DARPin-Based Probe for Imaging of HER2 Expression in Breast Cancer. Journal of Nuclear Medicine. 2022;63(4):528–535. DOI: 10.2967/jnumed.121.262542.Larkina M., Plotnikov E., Bezverkhniaia E., Shabanova Y., Tretyakova M., Yuldasheva F., Zelchan R., Schulga A., Konovalova E., Vorobyeva A. Comparative Preclinical Evaluation of Peptide-Based Chelators for the Labeling of DARPin G3 with <sup>99m</sup>Тс for Radionuclide Imaging of HER2 Expression in Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2022;23(21):13443.Larkina M., Plotnikov E., Bezverkhniaia E., Shabanova Y., Tretyakova M., Yuldasheva F., Zelchan R., Schulga A., Konovalova E., Vorobyeva A. Comparative Preclinical Evaluation of Peptide-Based Chelators for the Labeling of DARPin G3 with <sup>99m</sup>Tc for Radionuclide Imaging of HER2 Expression in Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2022;23(21):13443.Larkina M., Varvashenya R., Yuldasheva F., Plotnikov E., Bezverkhniaia E., Tretyakova M., Zelchan R., Schulga A., Konovalova E., Vorobyeva A., Belousov M., Orlova A., Tolmachev V., Deyev S. Comparative Preclinical Evaluation of HYNIC-Modified Designed Ankyrin Repeat Proteins G3 for the <sup>99m</sup>Тс-Based Imaging of HER2-Expressing Malignant Tumors. Molecular Pharmaceutics. 2024;21(4):1919–1932. DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.3c01173.Larkina M., Varvashenya R., Yuldasheva F., Plotnikov E., Bezverkhniaia E., Tretyakova M., Zelchan R., Schulga A., Konovalova E., Vorobyeva A., Belousov M., Orlova A., Tolmachev V., Deyev S. Comparative Preclinical Evaluation of HYNIC-Modified Designed Ankyrin Repeat Proteins G3 for the <sup>99m</sup>Tc-Based Imaging of HER2-Expressing Malignant Tumors. Molecular Pharmaceutics. 2024;21(4):1919–1932. DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.3c01173.Варвашеня Р. Н. Прач А. А., Плотников Е. B., Деев С. М., Белоусов М. В., Ларькина М. С., Чернов В. И. Оценка функциональной пригодности лиофилизата таргетных каркасных белков с анкириновыми повторами для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2/neu в злокачественных опухолях. Бюллетень сибирской медицины. 2024;23(3):16–24. DOI: 10.20538/1682-0363-2024-3-16-24.Varvashenya R. N. Prach A. A., Plotnikov E. B., Deev S. M., Belousov M. V., Larkina M. S., Chernov V. I. Assessing functional suitability of a lyophilized formulation containing designed ankyrin repeat proteins for radionuclide imaging of HER2/neu overexpression in malignant tumors. Bulletin of Siberian Medicine. 2024;23(3):16–24. (In Russ.) DOI: 10.20538/1682-0363-2024-3-16-24.Malakhov M. P., Mattern M. R., Malakhova O. A., Drinker M., Weeks S. D., Butt T. R. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural and Functional Genomics. 2004;5(1–2):75–86.Malakhov M. P., Mattern M. R., Malakhova O. A., Drinker M., Weeks S. D., Butt T. R. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural and Functional Genomics. 2004;5(1–2):75–86.Vorobyeva A., Sсhulga A., Konovalova E., Güler R., Mitran B., Garousi J., Rinne S., Löfblom J., Orlova A., Deyev S. Comparison of tumor-targeting properties of directly and indirectly radioiodinated designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 variants for molecular imaging of HER2. International Journal of Oncology. 2019;54(4):1209–1220.Vorobyeva A., Sсhulga A., Konovalova E., Güler R., Mitran B., Garousi J., Rinne S., Löfblom J., Orlova A., Deyev S. Comparison of tumor-targeting properties of directly and indirectly radioiodinated designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 variants for molecular imaging of HER2. International Journal of Oncology. 2019;54(4):1209–1220.Киселева Д. Г., Зигашин Р. Х., Фотин Д. П.,Маркин А. М., Проатерогенный протеомный профиль ЛПНП, полученных от пациентов с сахарным диабетом: иммунологические аспекты. Российский иммунологический журнал. 2024;27(2):253–258. DOI: 10.46235//1028-7221-16674-PPP.Kiseleva D. G., Zigashin R. H., Fotin D. P., Markin A. M. Proatherogenic proteomic profile of LDL isolated from plasma of patients with diabetes mellitus: immunological aspects. Russian Journal of Immunology. 2024;27(2):253–258. (In Russ.) DOI: 10.46235//1028-7221-16674-PPP.Ma B., Zhang K., Hendrie C., Liang C., Li M., Doherty-Kirby A., Lajoie G. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2003;17(20):2337–2342. DOI: 10.1002/rcm.1196.Ma B., Zhang K., Hendrie C., Liang C., Li M., Doherty-Kirby A., Lajoie G. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2003;17(20):2337–2342. DOI: 10.1002/rcm.1196.Gill S. C., von Hippel P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 1989;182(2):319–326. DOI: 10.1016/0003-2697(89)90602-7.Gill S. C., von Hippel P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 1989;182(2):319–326. DOI: 10.1016/0003-2697(89)90602-7.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.