198515, г. Санкт-Петербург, поселок Стрельна, ул. Связи, д. 34-А
34-A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint-Petersburg, 198515
198515, г. Санкт-Петербург, поселок Стрельна, ул. Связи, д. 34-А
34-A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint-Petersburg, 198515
198515, г. Санкт-Петербург, поселок Стрельна, ул. Связи, д. 34-А
34-A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint-Petersburg, 198515
198515, г. Санкт-Петербург, поселок Стрельна, ул. Связи, д. 34-А
34-A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint-Petersburg, 198515
198515, г. Санкт-Петербург, поселок Стрельна, ул. Связи, д. 34-А
34-A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint-Petersburg, 198515
198515, г. Санкт-Петербург, поселок Стрельна, ул. Связи, д. 34-А
34-A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint-Petersburg, 198515
198515, г. Санкт-Петербург, поселок Стрельна, ул. Связи, д. 34-А; 197101, г. Санкт-Петербург, Кронверкский проспект, д. 49, литер А
34-A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint-Petersburg, 198515; 49A, Kronverksky prospekt, Saint-Petersburg, 197101
198515, г. Санкт-Петербург, поселок Стрельна, ул. Связи, д. 34-А
34-A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint-Petersburg, 198515
198515, г. Санкт-Петербург, поселок Стрельна, ул. Связи, д. 34-А
34-A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint-Petersburg, 198515
Введение. Около 30 % генно-инженерных терапевтических белков производится в Escherichia coli. При наработке рекомбинантных белков одним из факторов, определяющих эффективность процесса и качество продукта, является показатель жизнеспособности клеток. Важно контролировать жизнеспособность при формировании банков клеток и оценке их стабильности в процессе хранения, а также при разработке условий культивирования штаммов. Изменение условий хранения или культивирования может приводить к изменению структуры клеточной популяции с изменением соотношения жизнеспособных, мертвых и находящихся в апоптозоподобной гибели (ALD, apoptosis-like death) клеток. Одним из способов оценки популяций клеток может являться метод проточной цитометрии с окрашиванием.
Цель. Разработать, валидировать и апробировать методику оценки жизнеспособности E. coli с использованием проточной цитометрии.
Материалы и методы. Для оценки жизнеспособности клеток проводили окрашивание E. coli пропидия йодидом (PI) и аннексином V-FITC (An-V-FITC). При помощи двойного окрашивания определяли популяции клеток живых, мертвых и в ALD. Валидацию методики проводили согласно Государственной фармакопее, решению Совета ЕЭК № 85 от 03.11.2016 и рекомендациям ICH. Анализировали применимость методики при разработке условий создания банков клеток и их культивировании.
Результаты и обсуждение. Разработана методика оценки жизнеспособности E. coli с использованием проточной цитометрии и окрашивания PI с An-V-FITC, позволяющая оценить популяции клеток живых, мертвых и в ALD. По итогам валидации методики установлено ее соответствие критериям: специфичности (6 %), линейности (R2 > 0,9), правильности (97–102 %), пределу количественного определения (подтвержден, 117 %), сходимости (1–10 %), внутрилабораторной прецизионности (2–17 %), аналитической области (6,4–100 %). При оптимизации условий создания банков клеток оценка жизнеспособности позволила определить, что для получения более 97 % жизнеспособных клеток после выхода из криоконсервации необходимо использовать соотношение объемов культуральной жидкости и криопротектора 3 к 1 при оптической плотности суспензии OD600 = 15. При разработке процесса культивирования штамма методика позволила определить оптимальные условия, в результате в биореакторе за 8 часов индукции процент мертвых клеток увеличился всего на 2,5 %, а клеток в состоянии ALD – на 7 %.
Заключение. Разработана и валидирована методика для оценки жизнеспособности E. coli, она может использоваться на этапе разработки и производства терапевтических продуктов.
Introduction. About 30 % of genetically engineered therapeutic proteins are produced in Escherichia coli. In the production of these proteins, cell viability is one of the key factors determining process efficiency and product quality. Controlling viability is essential when creating cell banks and optimizing E. coli cultivation conditions. Changes in cultivation parameters can affect viability and lead to shifts in the proportions of viable cells, dead cells, and cells undergoing apoptosis-like death (ALD). Flow cytometry is one method used to assess viability and distinguish between different cell populations.
Aim. To develop, validate and test a methodology for assessing the viability of E. coli using flow cytometry.
Materials and methods. To assess cell viability, we stained E. coli with propidium iodide (PI) and annexin V-FITC (An-V-FITC). We identified populations of live, dead, and ALD cells using dual staining with PI and An-V-FITC. The method was validated in accordance with the State Pharmacopoeia, the Decision of the EEC Council No. 85 dated 03.11.2016, and ICH guidelines. We evaluated the method’s applicability in developing conditions for cell bank creation and cultivation.
Results and discussion. We developed a method for assessing the viability of E. coli cells using flow cytometry and dual staining with PI and An-V-FITC, which enables the identification of live, dead, and ALD cell populations. Validation results demonstrated that the method meets the criteria: specificity (6 %), linearity (R2 > 0.9), accuracy (97–102 %), the limit of quantification (confirmed, 117 %), repeatability (1–10 %), intra-laboratory precision (2–17 %), analytical range (6.4–100 %). In selecting optimal conditions for cell bank creation, viability assessment enabled us to determine the optimal ratio of culture fluid to cryoprotectant (3 : 1) at an optical density of OD600 = 15, resulting in over 97 % viable cells after cryopreservation. During strain cultivation process development, the method facilitated the selection of optimal conditions. In the bioreactor, the proportion of dead cells increased by only 2.5 %, and the proportion of ALD cells increased by 7 % after 8 hours of induction.
Conclusion. We developed and validated a methodology for assessing E. coli viability that can be used during the development and production of therapeutic products.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.