pharmjournalРазработка и регистрация лекарственных средствDrug development & registration2305-20662658-5049LLC «CPHA»10.33380/2305-2066-2026-15-1-2217pharmjournal-2291Research ArticleМЕТОДЫ АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВANALYTICAL METHODSАнализ полифторсодержащего аналога нестероидного антиандрогена флутамида методами ядерного магнитного резонанса и жидкостной хроматографииAnalysis of a polyfluorinated analogue of the nonsteroidal antiandrogen flutamide by nuclear magnetic resonance and liquid chromatographyhttps://orcid.org/0000-0002-9133-0835КузьминаН. Е.Kuz’minaN. E.

127051, г. Москва, Петровский бульвар, д. 8, стр. 2

8/2, Petrovsky bulvar, Moscow, 127051

https://orcid.org/0009-0003-1170-2286АлешинС. В.AleshinS. V.

123182, г. Москва, площадь Академика Курчатова, д. 1

1, Ploshchad Academica Kurchatova, Moscow, 123182

https://orcid.org/0000-0002-6290-5142КузнецовС. Л.KuznetsovS. L.

123182, г. Москва, площадь Академика Курчатова, д. 1

1, Ploshchad Academica Kurchatova, Moscow, 123182

Kuznetsov_SL@nrcki.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9461-4219ТубашеваИ. А.TubashevaI. A.

123182, г. Москва, площадь Академика Курчатова, д. 1

1, Ploshchad Academica Kurchatova, Moscow, 123182

https://orcid.org/0000-0002-7198-8568ШуватоваВ. Г.ShuvatovaV. G.

123182, г. Москва, площадь Академика Курчатова, д. 1

1, Ploshchad Academica Kurchatova, Moscow, 123182

https://orcid.org/0000-0002-1976-1972СоколМ. Б.SokolM. B.

119334, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4

4, Kosygina str., Moscow, 119334

https://orcid.org/0000-0002-1931-3117НикольскаяЕ. Д.NikolskayaE. D.

119334, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4

4, Kosygina str., Moscow, 119334

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России)Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal ProductsФедеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» (НИЦ «Курчатовский институт»)National Research Centre "Kurchatov Institute"Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимической физики имени Н. М. Эмануэля» Российской академии наук (ИБХФ РАН)N. M. Emanuel Institute of Biochemical Physics of the Russian Academy of Sciences (IBCP RAS)202602032026151146160Copyright © Кузьмина Н.Е., Алешин С.В., Кузнецов С.Л., Тубашева И.А., Шуватова В.Г., Сокол М.Б., Никольская Е.Д., 20262026Кузьмина Н.Е., Алешин С.В., Кузнецов С.Л., Тубашева И.А., Шуватова В.Г., Сокол М.Б., Никольская Е.Д.Kuz’mina N.E., Aleshin S.V., Kuznetsov S.L., Tubasheva I.A., Shuvatova V.G., Sokol M.B., Nikolskaya E.D.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmjournal.ru/jour/article/view/2291Введение

Введение. В результате поиска более активных в отношении рака простаты полифторсодержащих структурных аналогов нестероидного антиандрогена флутамида был получен ряд соединений, среди которых наибольший интерес для дальнейшего изучения представлял 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-гептадекафтор-N-(4-нитро-3-(трифторметил)фенил) нонанамид (шифр F-4). Необходимые данные для строгого доказательства строения молекулы данного соединения ранее получены не были. Идентификация примесей и количественная оценка их содержания в субстанции F-4 не проводились. Для решения этих задач нами были использованы методы спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым (ВЭЖХ-УФ) и тандемным масс-селективным детектированием (ВЭЖХ-МС/МС).

Цель

Цель. Комплексный анализ строения соединения F-4 методами ЯМР и ВЭЖХ, а также идентификация и количественная оценка с их помощью содержания примесей в образцах субстанции.

Материалы и методы

Материалы и методы. Объектом исследования являлись лабораторные образцы субстанции соединения F-4, полученные ацилированием 4-нитро-3-(трифторметил)анилина хлорангидридом перфторпеларгоновой кислоты известным методом. Для анализа использовали: ЯМР-спектрометр Agilent DD2 NMR System 600; жидкостный хроматограф Agilent 1200, оснащенный диодно-матричным детектором G1315B; жидкостный хроматограф Agilent Infinity II, снабженный масс-спектрометрическим детектором с тройным квадруполем G6495C (Agilent Technologies, США). В обоих хроматографах применялась колонка Luna C18(2), 250 × 4,6 мм, 5 мкм (Phenomenex, США).

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Структурная интерпретация спектров 1Н-, 13С- и 19F-ЯМР образцов соединения F-4, проведенная с учетом значений химических сдвигов сигналов, их мультиплетности и данных 2D-экспериментов, однозначно свидетельствует о том, что F-4 имеет структуру 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-гептадекафтор-N-(4-нитро-3-(трифторметил) фенил)нонанамида. В спектрах 1Н- и 19F-ЯМР образцов субстанции F-4 также присутствовали сигналы двух примесных соединений, не относящихся к исходным веществам. Для их разделения был использован метод ВЭЖХ-УФ. С помощью ВЭЖХ-МС/МС при ионизации электроспреем в отрицательном режиме (–ESI) для всех пиков были зафиксированы высокоинтенсивные сигналы m/z, характерные для депротонированных молекулярных ионов. Строение обнаруженных примесей было подтверждено методами спектроскопии ЯМР. Результаты количественного определения относительного содержания примесей в образцах субстанции F-4 с применением методов 1Н- и 19F-ЯМР практически совпали, различия между полученными средними значениями статистически не были значимы.

Заключение

Заключение. В результате комплексного исследования методами ЯМР и ВЭЖХ установлено, что соединение F-4 соответствует структуре 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-гептадекафтор-N-(4-нитро-3-(трифторметил)фенил)нонанамида. В образцах субстанции F-4 были идентифицированы две родственные примеси, относительное содержание каждой примеси не превышало 1,7 %.

Introduction

Introduction. As a result of the search for more active polyfluoro-containing structural analogs of the non-steroidal antiandrogen flutamide against prostate cancer, a number of compounds were obtained, among which 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-heptadecafluoro-N-(4-nitro-3-(trifluoromethyl)phenyl)nonanamide (code F-4) was of the greatest interest for further study. The necessary data for rigorous proof of the molecular structure of this compound have not previously been obtained. Identification of impurities and quantitative assessment of their content in the F-4 substance have not been conducted. To address these issues, we used nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and high-performance liquid chromatography with ultraviolet (HPLC-UV) and tandem mass-selective detection (HPLC-MS/MS).

Aim

Aim. Comprehensive analysis of the structure of compound F-4 using NMR and HPLC methods, as well as identification and quantitative assessment using them of the content of impurities in samples of the substance.

Materials and methods

Materials and methods. The object of the study were laboratory samples of the substance of compound F-4, obtained by acylation of 4-nitro-3-(trifluoromethyl)aniline with perfluoropelargonic acid chloride using a known method. The following were used for the analysis: NMR spectrometer Agilent DD2 NMR System 600; liquid chromatograph Agilent 1200 equipped with diode array detector G1315B; liquid chromatograph Agilent Infinity II equipped with mass spectrometric detector with triple quadrupole G6495C (Agilent Technologies, USA). Both chromatographs used a column Luna C18(2), 250 × 4.6 mm, 5 μm (Phenomenex, USA).

Results and discussion

Results and discussion. Structural interpretation of the 1H, 13C, and 19F NMR spectra of F-4 samples, taking into account the chemical shift values of the signals, their multiplicity, and 2D experimental data, clearly indicates that F-4 has the structure of 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-heptadecafluoro-N-(4-nitro-3-(trifluoromethyl)phenyl)nonanamide. The 1H and 19F NMR spectra of the F-4 substance samples also contained signals of two impurity compounds not related to the starting materials. HPLC-UV method was used to separate them. Using HPLC-MS/MS with electrospray ionization in the negative mode (–ESI), high-intensity m/z signals characteristic of deprotonated molecular ions were recorded for all peaks. The structure of the detected impurities was confirmed using NMR spectroscopy. The results of quantitative determination of the relative impurity content in samples of F-4 substance using 1H and 19F NMR methods were virtually identical; the differences between the obtained average values were not statistically significant.

Conclusion

Conclusion. A comprehensive study using NMR and HPLC methods revealed that compound F-4 corresponds to the structure of 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-heptadecafluoro-N-(4-nitro-3-(trifluoromethyl)phenyl)nonanamide. Two related impurities were identified in samples of substance F-4, the relative content of each impurity did not exceed 1.7 %.

нестероидный антиандрогенфлутамидструктурный аналогЯМРВЭЖХродственная примесьnonsteroidal antiandrogenflutamidestructural analogueNMRHPLCrelated impurityРабота проведена в рамках выполнения государственного задания НИЦ «Курчатовский институт». Использовалось оборудование ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, ресурсного центра НИЦ «Курчатовский институт» и ИБХФ РАН.The work was carried out within the framework of the state assignment of the National Research Centre "Kurchatov Institute". The equipment used was from the Federal State Budgetary Institution "National Centre for Expertise and Medical Research" of the Ministry of Health of the Russian Federation, the resource center of the National Research Centre "Kurchatov Institute" and the N. M. Emanuel Institute of Biochemical Physics of the Russian Academy of Sciences.ReferencesМишугин С. В., Грицкевич А. А., Русаков И. Г. Эволюция изучения и клинического применения антиандрогенов в лечении распространенного рака предстательной железы. Медицинский Совет. 2016;(10):34–37. DOI: 10.21518/2079-701X-2016-10-34-37.Mishugin S. V., Gritskevich A. A., Rusakov I. G. Development and clinical effectiveness of antiandrogens in the treatment of advanced prostate cancer. Medical Council. 2016;(10):34–37. (In Russ.) DOI: 10.21518/2079-701X-2016-10-34-37.Бухаркин Б. В., Гриднева Я. В., Митин А. А. Нестероидные антиандрогены в лечении рака предстательной железы. Русский медицинский журнал. 2009;17(22):1497–1499.Bukharkin B. V., Gridneva Ya. V., Mitin A. A. Nonsteroidal antiandrogens in the treatment of prostate cancer. Russian Medical Journal. 2009;17(22):1497–1499. (In Russ.)Бухаркин Б. В., Аксенов А. А. Применение антиандрогенов в монорежиме при лечении рака предстательной железы. Онкоурология. 2005;(5):43–47.Bukharkin B. V., Aksenov A. A. Use of antiandrogens in monotherapy in the treatment of prostate cancer. Canser Urology. 2005;(3):43–47. (In Russ.)Носов Д. А., Волкова М. И., Гладков О. А., Карабина Е. В., Крылов В. В., Матвеев В. Б., Усычкин С. В., Митин Т. Рак предстательной железы. Злокачественные опухоли. 2024;14(3s2-2):242−266. DOI: 10.18027/2224-5057-2024-14-3s2-1.2-10.Nosov D. A., Volkova M. I., Gladkov O. A., Karabina E. V., Krylov V. V., Matveev V. B., Usychkin S. V., Mitin T. Prostate cancer. Malignant tumors. 2024;14(3s2-2):242–266. (In Russ.) DOI: 10.18027/2224-5057-2024-14-3s2-1.2-10.Зиганшина Л. Е., Лепахин В. К., Петров В. И., Хабриева Р. У., ред. Большой справочник лекарственных средств. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2011. 3344 с.Ziganshina L. E., Lepakhin V. K., Petrov V. I., Khabrieva R. U., editors. Large reference book of medicine. Moscow: GEOTAR-Media; 2011. 3344 p. (In Russ.)Sternal R., Nugara N. Flutamide. Analytical Profiles of Drug Substances and Excipients. Vol. 27. In: Brittain H. G., editor. Analytical profiles of drug substances. Volume 27. San Diego: Academic Press; 2001. P. 115–157.Sternal R., Nugara N. Flutamide. Analytical Profiles of Drug Substances and Excipients. Vol. 27. In: Brittain H. G., editor. Analytical profiles of drug substances. Volume 27. San Diego: Academic Press; 2001. P. 115–157.Ушкалова Е. А., Зырянов С. К., Гопиенко И. А. Ингибиторы андрогенных рецепторов второго поколения в терапии неметастатического кастрационно-резистентного рака предстательной железы: роль профиля безопасности и влияния на качество жизни. Вопросы онкологии. 2021;67(2):217–226. DOI: 10.37469/0507-3758-2021-67-2-217-226.Ushkalova E. A., Zyryanov S. K., Gopienko I. A. Second-generation androgen receptor inhibitors in therapy of non-metastatic castration resistant prostate cancer: role of safety profile and effect on quality of life. Problems in Oncology. 2021;67(2):217–226. (In Russ.) DOI: 10.37469/0507-3758-2021-67-2-217-226.Kandil S. B., McGuigan C., Westwell A. D. Synthesis and Biological Evaluation of Bicalutamide Analogues for the Potential Treatment of Prostate Cancer. Molecules. 2020;26(1):56. DOI: 10.3390/molecules26010056.Kandil S. B., McGuigan C., Westwell A. D. Synthesis and Biological Evaluation of Bicalutamide Analogues for the Potential Treatment of Prostate Cancer. Molecules. 2020;26(1):56. DOI: 10.3390/molecules26010056.Крюкова Л. Ю., Москалева Е. Ю., Астахов Д. В., Посыпанова Г. А., Родина А. В., Поташников П. Ф., Воронцов Е. А., Кузнецов С. Л., Крюков Л. Н., Северин С. Е. Синтез полифторсодержащих аналогов флутамида и их цитотоксическая активность. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1998;(3):29–32.Kryukova L. Yu., Moskaleva E. Yu., Astakhov D. V., Posypanova G. A., Rodina A. V., Potashnikov P. F., Vorontsov E. A., Kuznetsov S. L., Kryukov L. N., Severin S. E. Synthesis of polyfluorinated analogues of flutamide and their cytotoxic activity. Problems of Biological, Medical and Pharmaceutical chemistry. 1998;(3):29–32. (In Russ.)Катлинский А. В., Северин Е. С., Северин С. Е., Крюков Л. Н., Москалева Е. Ю., Воронцов Е. А., Смирнова З. С., Крюкова Л. Ю., Белушкина Н. Н., Кузнецов С. Л., Фельдман Н. Б., Пальцев М. А. Аналоги флутамида: синтез, биоактивность и перспективы медицинского применения. Молекулярная медицина. 2003;(2):60–64.Katlinskiy A. V., Severin E. S., Severin S. E., Kryukov L. N., Moskaleva E. Yu., Vorontsov E. A., Smirnova Z. S., Kryukova L. Yu., Belushkina N. N., Kuznetsov S. L., Feldman N. B., Paltsev M. A. Analogues of flutamide: synthesis, biological activity and prospects of medical application. Molecular medicine. 2003;(2):60–64. (In Russ.)Аляутдин Р. Н., Воронцов Е. А., Иванов А. А., Крюков Л. Н., Кузнецов С. Л., Москалева Е. Ю., Пальцев М. А., Посыпанова Г. А., Северин Е. С., Северин С. Е., Хомяков Ю. Н. 4-Нитро-3-трифторметил-перфторнонаноиланилид (флустат), способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе. Патент РФ на изобретение № 2186057 С1 от 27.07.2002. Доступно по: https://patents.google.com/patent/RU2186057C1/ru?oq=RU2186057C1. Ссылка активна на 07.02.2025.Alyautdin R. N., Vorontsov E. A., Ivanov A. A., Kryukov L. N., Kuznetsov S. L., Moskaleva E. Yu., Paltsev M. A., Posypanova G. A., Severin E. S., Severin S. E., Khomyakov Yu. N. 4-Nitro-3-fluoromethylperfluorononanoylanilide (flustat), method if its synthesis and pharmaceutical composition based on thereof. Patent RUS No. 2186057 С1 dated 27.07.2002. Available at: https://patents.google.com/patent/RU2186057C1/en?oq=RU2186057C1. Accessed: 07.02.2024. (In Russ.)Моисеев С. В., Крылов В. И., Мастеркова Т. В., Яшкир В. А., Бунятян Н. Д. Использование метода ЯМР-спектроскопии для подтверждения подлинности, идентификации и количественного определения посторонних примесей субстанции салициловой кислоты. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. 2014;(1):15–19.Moiseev S. V., Krylov V. I., Masterkova T. V., Yashkir V. A., Bunyatyan N. D. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for drug identification, characterization and quantification of impurities in substance of salicylic acid. Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products. Regulatory Research and Medicine Evaluation. 2014;(1):15–19. (In Russ.)Кузьмина Н. Е., Моисеев С. В., Якупов И. Ю., Кулешова С. И. Количественное определение основных компонентов в лекарственных препаратах полимиксина В методом ЯМР-спектроскопии. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. 2025;15(2):206–212. DOI: 10.30895/1991-2919-2025-15-2-206-212.Kuz’mina N. E., Moiseev S. V., Yakupov I. Yu., Kuleshova S. I. Quantitative Determination of Major Active Components in Polymyxin B Medicinal Products by NMR Spectroscopy. Regulatory Research and Medicine Evaluation. 2025;15(2):206–212. (In Russ.). DOI: 10.30895/1991-2919-2025-15-2-206-212.Сапон Е. С., Лугин В. Г., Совастей О. Г., Ефремова А. А., Гарипов Р. М. Применение ВЭЖХ-МС с электроспрей ионизацией для качественного анализа антибиотиков цефолоспоринового ряда. Вестник казанского технологического университета. 2014;17(17):136–138.Sapon E. S., Lugin V. G., Sovastey O. G., Efremova A. A., Garipov R. M. Application of electrospray ionization HPLC-MS for qualitative analysis of cepholosporin antibiotics. Bulletin of Kazan technological university. 2014;17(17):136–138. (In Russ.)Gottlieb H. E., Kotlyar V., Nudelman A. NMR Chemical Shifts of Common Laboratory Solvents as Trace Impurities. The Journal of Organic Chemistry. 1997;62(21):7512–7515. DOI: 10.1021/jo971176v.Gottlieb H. E., Kotlyar V., Nudelman A. NMR Chemical Shifts of Common Laboratory Solvents as Trace Impurities. The Journal of Organic Chemistry. 1997;62(21):7512–7515. DOI: 10.1021/jo971176v.Зенкевич И. Г., Иоффе Б. В. Интерпретация масс-спектров органических соединений. Л.: Химия; 1986. С. 61–65.Zenkevich I. G., Ioffe B. V. Interpretation of mass spectra of organic compounds. Leningrad: Khimiya; 1986. P. 61–65. (In Russ.)

The authors declare that there are no conflicts of interest present.