pharmjournalРазработка и регистрация лекарственных средствDrug development & registration2305-20662658-5049LLC «CPHA»10.33380/2305-2066-2026-15-2-2103pharmjournal-2374Research ArticleДОКЛИНИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯPRECLINICAL AND CLINICAL STUDIESФизико-химическая и биологическая характеризация лекарственного препарата РинЛиз®Physicochemical and biological characterization of the medicinal product RinLis®https://orcid.org/0000-0002-9384-8064АрутюнянС. С.ArutyunyanS. S.

198515, г. Санкт-Петербург, пос. Стрельна, ул. Связи, д. 34, лит. А

34A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint Petersburg, 198515

Sona.Arutiunian@geropharm.comhttps://orcid.org/0000-0003-4594-6097ДрайР. В.DraiR. V.

198515, г. Санкт-Петербург, пос. Стрельна, ул. Связи, д. 34, лит. А

34A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint Petersburg, 198515

https://orcid.org/0000-0003-3840-5049ЛуговикИ. А.LugovikI. A.

198515, г. Санкт-Петербург, пос. Стрельна, ул. Связи, д. 34, лит. А

34A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint Petersburg, 198515

https://orcid.org/0000-0003-3024-4009БабинаА. В.BabinaA. V.

198515, г. Санкт-Петербург, пос. Стрельна, ул. Связи, д. 34, лит. А

34A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint Petersburg, 198515

https://orcid.org/0000-0002-8445-1129СапароваВ. Б.SaparovaV. B.

198515, г. Санкт-Петербург, пос. Стрельна, ул. Связи, д. 34, лит. А; 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1

34A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint Petersburg, 198515; 20/1, Delegatskaya str., Moscow, 127473

https://orcid.org/0000-0001-7073-311XСельменскихТ. А.SelmenskikhT. A.

198515, г. Санкт-Петербург, пос. Стрельна, ул. Связи, д. 34, лит. А

34A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint Petersburg, 198515

https://orcid.org/0009-0008-8467-9781ЗаикинП. Г.ZaikinP. G.

198515, г. Санкт-Петербург, пос. Стрельна, ул. Связи, д. 34, лит. А

34A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint Petersburg, 198515

https://orcid.org/0000-0002-1931-9455ЕлтышеваТ. Э.EltyshevaT. E.

198515, г. Санкт-Петербург, пос. Стрельна, ул. Связи, д. 34, лит. А

34A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint Petersburg, 198515

https://orcid.org/0000-0003-2308-0608МакаренкоИ. Е.MakarenkoI. E.

198515, г. Санкт-Петербург, пос. Стрельна, ул. Связи, д. 34, лит. А; 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1

34A, Svyazi str., Strelna settlement, Saint Petersburg, 198515; 20/1, Delegatskaya str., Moscow, 127473

Закрытое акционерное общество «Фарм-Холдинг»Closed Joint-Stock Company "Pharm-Holding"Закрытое акционерное общество «Фарм-Холдинг»; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет медицины» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО «Российский университет медицины» Минздрава России)Closed Joint-Stock Company "Pharm-Holding"; Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Russian University of Medicine" of the Ministry of Health of the Russian Federation202611062026152190205Copyright © Арутюнян С.С., Драй Р.В., Луговик И.А., Бабина А.В., Сапарова В.Б., Сельменских Т.А., Заикин П.Г., Елтышева Т.Э., Макаренко И.Е., 20262026Арутюнян С.С., Драй Р.В., Луговик И.А., Бабина А.В., Сапарова В.Б., Сельменских Т.А., Заикин П.Г., Елтышева Т.Э., Макаренко И.Е.Arutyunyan S.S., Drai R.V., Lugovik I.A., Babina A.V., Saparova V.B., Selmenskikh T.A., Zaikin P.G., Eltysheva T.E., Makarenko I.E.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmjournal.ru/jour/article/view/2374Введение

Введение. Доступ к инсулину ограничен глобальными барьерами, среди которых ключевым является монопольное ценообразование транснациональных компаний-оригинаторов. Утрата патентной защиты открывает путь для производства биоаналогов – более доступных препаратов, сопоставимых по качеству, эффективности и безопасности. Императивом разработки биоаналогов является проведение комплексных исследований сопоставимости с оригинальным препаратом, включающих физико-химическую и биологическую характеризацию. Разработка программы исследований сопоставимости, а именно выбор атрибутов и ортогональных методов для изучения структуры и функциональной состоятельности молекулы инсулина, должна основываться на глубоком понимании структуры и свойств молекулы, а также на последних научных знаниях.

Цель

Цель. Провести физико-химическую и биологическую характеризацию препарата РинЛиз® (GP40011) в сравнении с оригинальным препаратом Хумалог® (инсулин лизпро) для установления их сопоставимости в рамках оценки биоаналогичности.

Материалы и методы

Материалы и методы. Первичную структуру белка подтверждали с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией и пептидного картирования. Структуры белка более высокого порядка были исследованы следующими методами: капиллярным изоэлектрофокусированием, методом Эллмана, круговым дихроизмом, флуоресцентной спектрофотометрией, динамическим рассеянием света. Сопоставимость профилей примесей исследуемых препаратов изучали с помощью методов эксклюзионной хроматографии и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для характеризации функциональных свойств и биологической активности препаратов оценивали кинетику связывания с инсулиновыми рецепторами IR-A и IR-B, аутофосфорилирование инсулинового рецептора и проводили метаболические клеточные тесты («Захват глюкозы», «Инсулининдуцированный липогенез», «Ингибирование стимулированного липолиза»).

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. По результатам оценки физико-химических свойств для препарата GP40011 была установлена высокая степень сходства с референтным препаратом Хумалог® по первичной структуре белка, структурам более высокого порядка, а также по профилю примесей. Оценка функциональных характеристик показала, что препараты GP40011 и Хумалог® имели идентичную кинетику связывания с инсулиновыми рецепторами IR-A и IR-B и демонстрировали сопоставимую биологическую активность.

Заключение

Заключение. По результатам проведенного исследования была продемонстрирована полная аналитическая сопоставимость препаратов РинЛиз® и Хумалог®. Проведенное исследование внесло значимый вклад в научное обоснование эквивалентности биосимиляра РинЛиз® и референтного препарата Хумалог®, тем самым обеспечив надежную основу для успешной регистрации и последующего клинического применения.

Introduction

Introduction. Access to insulin is limited by global barriers, the most crucial of which is the pricing monopoly of multinational originator companies. The expiry of patent on the originator product opens the way for the production of biosimilars being affordable products with comparable quality, effectiveness and safety. The imperative for the development of biosimilars is to conduct comprehensive comparability studies with the originator product, including physicochemical and biological characterization. The development of a comparability study program, specifically the selection of attributes and orthogonal methods for analyzing the structure and the functional integrity of the insulin molecule, should be based on a deep understanding of the structure and properties of the molecule, as well as on the latest scientific knowledge.

Aim

Aim. To conduct physicochemical and biological characterization of the medicinal product RinLis® (GP40011) in comparison with the originator medicinal product Humalog® (insulin lispro) to establish their comparability within the framework of the biosimilarity assessment.

Materials and methods

Materials and methods. The primary protein structure was confirmed using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and peptide mapping. Higher-order protein structures were investigated using capillary isoelectric focusing, Ellman's method, circular dichroism, fluorescence spectrophotometry and dynamic light scattering. The comparability of impurity profiles of the tested batches was studied using size-exclusion chromatography (SEC) and reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP HPLC). Insulin receptor (IR-A and IR-B) binding kinetics assay, insulin receptor phosphorylation assay and metabolic cell-based assays (glucose uptake, insulin-induced lipogenesis, inhibition of stimulated lipolysis) were performed to characterize the functional properties and biological activity of the insulin products.

Results and discussion

Results and discussion. GP40011 was found to have high similarity to the reference product Humalog® in terms of the primary protein structure, higher-order structures and impurity profile based on the results of the evaluation of the physicochemical properties. Functional characterization studies showed that GP40011 and Humalog® had identical insulin receptor binding kinetics to IR-A, IR-B and comparable biological activity.

Conclusion

Conclusion. The study results demonstrated full analytical similarity of RinLis® to Humalog®. The study made a significant contribution to the scientific substantiation of the equivalence of the biosimilar RinLis® and the reference product Humalog®, thereby providing a reliable basis for successful approval and subsequent clinical use.

инсулин лизпробиосимилярбиоаналогбиоподобиеаналитическая сопоставимостьхарактеризацияфизико-химические свойствабиологическая активностьinsulin lisprobiosimilarbioanaloguebiosimilarityanalytical comparabilitycharacterizationphysicochemical propertiesbiological activityСпонсор данного исследования – ООО «ГЕРОФАРМ».The sponsor of this study is LLC "GEROPHARM".ReferencesGBD 2021 Diabetes Collaborators. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. The Lancet. 2023;402(10397):203–234. DOI: 10.1016/S0140-6736(23)01301-6.GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. The Lancet. 2023;402(10397):203–234. DOI: 10.1016/S0140-6736(23)01301-6.Flood D., Seiglie J. A., Dunn M., Tschida S., Theilmann M., Marcus M. E., Brian G., Norov B., Mayige M. T., Singh Gurung M., Aryal K. K., Labadarios D., Dorobantu M., Silver B. K., Bovet P., Jorgensen J. M. A., Guwatudde D., Houehanou C., Andall-Brereton G., Quesnel-Crooks S., Sturua L., Farzadfar F., Saeedi Moghaddam S., Atun R., Vollmer S., Bärnighausen T. W., Davies J. I., Wexler D. J., Geldsetzer P., Rohloff P., Ramírez-Zea M., Heisler M., Manne-Goehler J. The state of diabetes treatment coverage in 55 low-income and middle-income countries: a cross-sectional study of nationally representative, individual-level data in 680 102 adults. The Lancet Healthy Longevity. 2021;2(6): E340–E351. DOI: 10.1016/S2666-7568(21)00089-1.Flood D., Seiglie J. A., Dunn M., Tschida S., Theilmann M., Marcus M. E., Brian G., Norov B., Mayige M. T., Singh Gurung M., Aryal K. K., Labadarios D., Dorobantu M., Silver B. K., Bovet P., Jorgensen J. M. A., Guwatudde D., Houehanou C., Andall-Brereton G., Quesnel-Crooks S., Sturua L., Farzadfar F., Saeedi Moghaddam S., Atun R., Vollmer S., Bärnighausen T. W., Davies J. I., Wexler D. J., Geldsetzer P., Rohloff P., Ramírez-Zea M., Heisler M., Manne-Goehler J. The state of diabetes treatment coverage in 55 low-income and middle-income countries: a cross-sectional study of nationally representative, individual-level data in 680 102 adults. The Lancet Healthy Longevity. 2021;2(6): E340–E351. DOI: 10.1016/S2666-7568(21)00089-1.Beran D., Ewen M., Laing R. Constraints and challenges in access to insulin: a global perspective. The Lancet Diabetes & Endocrinology. 2016;4(3):275–285. DOI: 10.1016/S2213-8587(15)00521-5.Beran D., Ewen M., Laing R. Constraints and challenges in access to insulin: a global perspective. The Lancet Diabetes & Endocrinology. 2016;4(3):275–285. DOI: 10.1016/S2213-8587(15)00521-5.Agbogbo F. K., Ecker D. M., Farrand A., Han K., Khoury A., Martin A., McCool J., Rasche U., Rau T. D., Schmidt D., Sha M., Treuheit N. Current perspectives on biosimilars. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 2019;46(9–10):1297–1311. DOI: 10.1007/s10295-019-02216-z.Agbogbo F. K., Ecker D. M., Farrand A., Han K., Khoury A., Martin A., McCool J., Rasche U., Rau T. D., Schmidt D., Sha M., Treuheit N. Current perspectives on biosimilars. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 2019;46(9–10):1297–1311. DOI: 10.1007/s10295-019-02216-z.Morolla D., Beran D., Ewen M., Raviglione M., von Schoen-Angerer T. Role of biosimilar introduction on insulin glargine prices: a retrospective analysis in 28 European countries. BMJ Open. 2025;15(1):e090484. DOI: 10.1136/bmjopen-2024-090484.Morolla D., Beran D., Ewen M., Raviglione M., von Schoen-Angerer T. Role of biosimilar introduction on insulin glargine prices: a retrospective analysis in 28 European countries. BMJ Open. 2025;15(1):e090484. DOI: 10.1136/bmjopen-2024-090484.Koivisto V. A. The human insulin analogue insulin lispro. Annals of Medicine. 1998;30(3):260–266. DOI: 10.3109/07853899809005853.Koivisto V. A. The human insulin analogue insulin lispro. Annals of Medicine. 1998;30(3):260–266. DOI: 10.3109/07853899809005853.Posner B. I. Insulin Signalling: The Inside Story. Canadian Journal of Diabetes. 2017;41(1):108–113. DOI: 10.1016/j.jcjd.2016.07.002.Posner B. I. Insulin Signalling: The Inside Story. Canadian Journal of Diabetes. 2017;41(1):108–113. DOI: 10.1016/j.jcjd.2016.07.002.Hsu J.-C., Lai B.-Y., Hsieh W.-L., Wang D.-Y., Shih D. Y.-C., Lo C.-F. Identification of recombinant insulin analogues by peptide mapping method. Journal of Food and Drug Analysis. 2012;20(4):7. DOI: 10.6227/jfda.2012200427.Hsu J.-C., Lai B.-Y., Hsieh W.-L., Wang D.-Y., Shih D. Y.-C., Lo C.-F. Identification of recombinant insulin analogues by peptide mapping method. Journal of Food and Drug Analysis. 2012;20(4):7. DOI: 10.6227/jfda.2012200427.Sklepari M., Rodger A., Reason A., Jamshidi S., Prokes I., Blindauer C. A. Biophysical characterization of a protein for structure comparison: methods for identifying insulin structural changes. Analytical Methods. 2016;8(41):7460–7471. DOI: 10.1039/C6AY01573E.Sklepari M., Rodger A., Reason A., Jamshidi S., Prokes I., Blindauer C. A. Biophysical characterization of a protein for structure comparison: methods for identifying insulin structural changes. Analytical Methods. 2016;8(41):7460–7471. DOI: 10.1039/C6AY01573E.Patil S. M., Keire D. A., Chen K. Comparison of NMR and Dynamic Light Scattering for Measuring Diffusion Coefficients of Formulated Insulin: Implications for Particle Size Distribution Measurements in Drug Products. The AAPS Journal. 2017;19(6):1760–1766. DOI: 10.1208/s12248-017-0127-z.Patil S. M., Keire D. A., Chen K. Comparison of NMR and Dynamic Light Scattering for Measuring Diffusion Coefficients of Formulated Insulin: Implications for Particle Size Distribution Measurements in Drug Products. The AAPS Journal. 2017;19(6):1760–1766. DOI: 10.1208/s12248-017-0127-z.Бабина А. В., Драй Р. В., Сапарова В. Б., Афанасьева А. Н., Заикин П. Г., Шмурак В. И., Елтышева Т. Э., Макаренко И. Е. Физико-химическая и функциональная характеризация лекарственного препарата Ринсулин® Р. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2023;12(2):124–134. DOI: 10.33380/2305-2066-2023-12-2-124-134.Babina A. V., Drai R. V., Saparova V. B., Afanasyeva A. N., Zaikin P. G., Shmurak V. I., Eltysheva T. E., Makarenko I. E. Physicochemical and functional characterization of medicinal product Rinsulin® R. Drug development & registration. 2023;12(2):124–134. (In Russ.) DOI: 10.33380/2305-2066-2023-12-2-124-134.]Korn M., Wohlfart P., Gossas T., Kullman-Magnusson M., Niederhaus B., Dedio J., Tennagels N. Comparison of metabolic and mitogenic response in vitro of the rapid-acting insulin lispro product SAR342434, and US- and EU-approved Humalog®. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2019;109:104497. DOI: 10.1016/j.yrtph.2019.104497.Korn M., Wohlfart P., Gossas T., Kullman-Magnusson M., Niederhaus B., Dedio J., Tennagels N. Comparison of metabolic and mitogenic response in vitro of the rapid-acting insulin lispro product SAR342434, and US- and EU-approved Humalog®. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2019;109:104497. DOI: 10.1016/j.yrtph.2019.104497.Somwar R., Sweeney G., Ramlal T., Klip A. Stimulation of glucose and amino acid transport and activation of the insulin signaling pathways by insulin lispro in L6 skeletal muscle cells. Clinical Therapeutics. 1998;20(1):125–140. DOI: 10.1016/s0149-2918(98)80040-4.Somwar R., Sweeney G., Ramlal T., Klip A. Stimulation of glucose and amino acid transport and activation of the insulin signaling pathways by insulin lispro in L6 skeletal muscle cells. Clinical Therapeutics. 1998;20(1):125–140. DOI: 10.1016/s0149-2918(98)80040-4.Owens R. A., Hansen R. J., Kahl S. D., Zhang C., Ruan X., Koester A., Li S., Qian H.-R., Farmen M. W., Michael M. D., Moyers J. S., Cutler G. B. Jr., Vick A., Beals J. M. In Vivo and In Vitro Characterization of Basal Insulin Peglispro: A Novel Insulin Analog. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2016;357(3):459-465. DOI: 10.1124/jpet.115.231035.Owens R. A., Hansen R. J., Kahl S. D., Zhang C., Ruan X., Koester A., Li S., Qian H.-R., Farmen M. W., Michael M. D., Moyers J. S., Cutler G. B. Jr., Vick A., Beals J. M. In Vivo and In Vitro Characterization of Basal Insulin Peglispro: A Novel Insulin Analog. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2016;357(3):459-465. DOI: 10.1124/jpet.115.231035.Byrd R. A., Owens R. A., Blackbourne J. L., Coutant D. E., Farmen M. W., Michael M. D., Moyers J. S., Schultze A. E., Sievert M. K., Tripathi N. K., Vahle J. L. Nonclinical pharmacology and toxicology of the first biosimilar insulin glargine drug product (BASAGLAR®/ABASAGLAR®) approved in the European Union. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2017;88:56–65. DOI: 10.1016/j.yrtph.2017.05.013.Byrd R. A., Owens R. A., Blackbourne J. L., Coutant D. E., Farmen M. W., Michael M. D., Moyers J. S., Schultze A. E., Sievert M. K., Tripathi N. K., Vahle J. L. Nonclinical pharmacology and toxicology of the first biosimilar insulin glargine drug product (BASAGLAR®/ABASAGLAR®) approved in the European Union. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2017;88:56–65. DOI: 10.1016/j.yrtph.2017.05.013.Ghade N. S., Thappa D. K., Lona J., Krishnan A. R., Sonar S. M. Comparative physicochemical and structural characterisation studies establish high biosimilarity between BGL-ASP and reference insulin aspart. Scientific Reports. 2024;14(1):4224. DOI: 10.1038/s41598-024-54819-x.Ghade N. S., Thappa D. K., Lona J., Krishnan A. R., Sonar S. M. Comparative physicochemical and structural characterisation studies establish high biosimilarity between BGL-ASP and reference insulin aspart. Scientific Reports. 2024;14(1):4224. DOI: 10.1038/s41598-024-54819-x.Goyal P., Pai H. V., Kodali P., Vats B., Vajpai N., Annegowda S., Mane K., Mohan S., Saxena S., Veerabhadraia A. B., Palande M., Nair P. S., More D. C., Rao Karudumpa U., Jyothirmai K., Bhattacharya A., Almeida F., Khyade S. G., Gouda S., Ranayhossaini D. J., Reddy Moole P., Smith J. P., Barve A., Melarkode R., Ullanat R. Physicochemical and functional characterization of MYL-1501D, a proposed biosimilar to insulin glargine. PLoS ONE. 2021;16(6):e0253168. DOI: 10.1371/journal.pone.0253168.Goyal P., Pai H. V., Kodali P., Vats B., Vajpai N., Annegowda S., Mane K., Mohan S., Saxena S., Veerabhadraia A. B., Palande M., Nair P. S., More D. C., Rao Karudumpa U., Jyothirmai K., Bhattacharya A., Almeida F., Khyade S. G., Gouda S., Ranayhossaini D. J., Reddy Moole P., Smith J. P., Barve A., Melarkode R., Ullanat R. Physicochemical and functional characterization of MYL-1501D, a proposed biosimilar to insulin glargine. PLoS ONE. 2021;16(6):e0253168. DOI: 10.1371/journal.pone.0253168.Афанасьева А. Н., Сапарова В. Б., Макаренко И. Е., Драй Р. В., Сельменских Т. А. Опыт проведения валидации in vitro методики оценки инсулинозависимого захвата глюкозы. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. 2023;13(1):77–88. DOI: 10.30895/1991-2919-2022-398.Afanasyeva A. N., Saparova V. B., Makarenko I. E., Drai R. V., Selmenskikh T. A. Experimental validation of an in vitro method for assessing insulin-dependent glucose uptake. Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products. Regulatory Research and Medicine Evaluation. 2023;13(1):77–88. DOI: 10.30895/1991-2919-2022-398.]Zhou C., Qi W., Lewis E. N., Carpenter J. F. Characterization of sizes of aggregates of insulin analogs and the conformations of the constituent protein molecules: a concomitant dynamic light scattering and Raman spectroscopy study. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2016;105(2):551–558. DOI: 10.1016/j.xphs.2015.10.023.Zhou C., Qi W., Lewis E. N., Carpenter J. F. Characterization of sizes of aggregates of insulin analogs and the conformations of the constituent protein molecules: a concomitant dynamic light scattering and Raman spectroscopy study. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2016;105(2):551–558. DOI: 10.1016/j.xphs.2015.10.023.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.