pharmjournalРазработка и регистрация лекарственных средствDrug development & registration2305-20662658-5049LLC «CPHA»10.33380/2305-2066-2019-8-3-70-78pharmjournal-717Research ArticleДОКЛИНИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯPRECLINICAL AND CLINICAL STUDIESРазработка и валидация методики определения нейтрализующих антител к инсулину (гларгин) в плазме крови человекаDevelopment and Validation of Approach for the Detection of Neutralizing Antibodies Against Insulin (Glargine) in Human Blood PlasmaАбраменкоН. Б.AbramenkoN. B.

119991, г. Москва, Ленинский проспект, д. 47;

119071, Москва, Ленинский просп., д. 33;

117246, Москва, Научный проезд, д. 20, стр. 2

47, Leninsky av., Moscow, 119991;

33, Leninsky av., Moscow, 119071;

20/2, Nauchny Proezd, Moscow, 117246

n.abramenko@exactelabs.comВнуковаП. И.VnukovaP. I.

109472, Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23

20/2, Nauchny Proezd, Moscow, 117246; 

23, Academician Scriabin str., Moscow, 109472

ГоловинаЕ. С.GolovinaE. S.МакаренкоИ. Е.MakarenkoI. E.

191119, Санкт-Петербург, ул. Звенигородская, д. 9

МосикянА. А.MosikianA. A.

191119, Санкт-Петербург, ул. Звенигородская, д. 9

НикифороваА. Г.NikiforovaA. G.ГремяковаП. В.GremyakovaP. V.КазейВ. И.KazeyV. I.ФГБУН институт органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН; ФГБУН институт проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН; ООО «Экзактэ Лабс»N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry Russian Academy of Sciences; N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution RAS; LLC «Exacte Labs»;ООО «Экзактэ Лабс»; Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии-МВА имени К. И. СкрябинаLLC «Exacte Labs»; K.I. Scriabin Moscow State Academy of Veterinary Medicine and BiotechnologyООО «Экзактэ Лабс»LLC «Exacte Labs»ООО «ГЕРОФАРМ»LLC «GEROFARM»201904092019837078Copyright © Абраменко Н.Б., Внукова П.И., Головина Е.С., Макаренко И.Е., Мосикян А.А., Никифорова А.Г., Гремякова П.В., Казей В.И., 20192019Абраменко Н.Б., Внукова П.И., Головина Е.С., Макаренко И.Е., Мосикян А.А., Никифорова А.Г., Гремякова П.В., Казей В.И.Abramenko N.B., Vnukova P.I., Golovina E.S., Makarenko I.E., Mosikian A.A., Nikiforova A.G., Gremyakova P.V., Kazey V.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmjournal.ru/jour/article/view/717Введение

Введение. Проведение исследования иммуногенности терапевтических белков, таких как аналоги человеческого инсулина, является одним из актуальных и востребованных направлений в медицине и фармацевтике. Определение возможности выработки нейтрализующих антител к инсулину, уменьшающих терапевтических эффект принимаемого препарата у пациентов, является важным этапом для понимания фармакологического профиля лекарственного препарата. Применение клеточных методов анализа на антитела позволяет проводить определение нейтрализующих антител к инсулину.

Цель

Цель. Адаптация и валидация методики оценки иммуногенности инсулина в плазме крови человека.

Материалы и методы

Материалы и методы. В основе метода лежит использование клеточной линии iLiteTM Insulin Assay Ready Cells [1], в геном которой встроен репортёрный ген люциферазы светлячка (Firefly) под контролем инсулинозависимого промотора. При увеличении концентрации инсулина экспрессия люциферазы светлячка (Firefly) увеличивается, что позволяет использовать данную клеточную линию для оценки количества нейтрализующих инсулин антител. Для нормализации по количеству клеток и учёта влияния матричного эффекта исследуемых образцов используется второй репортёрный ген люциферазы Renilla, который экспрессируется под контролем конститутивного промотора. Активность обеих люцифераз измеряли с помощью набора реагентов DualGlo Luciferase Assay System (Promega) [2].

Результаты и обсуждения

Результаты и обсуждения. Были установлены оптимальные концентрация инсулина и степень разбавления плазмы/сыворотки для определения нейтрализующих антител к инсулину. Показана долгосрочная стабильность нейтрализующих антител к инсулину в плазме крови человека более 3-х месяцев. Описанная методика были применена при сравнительном исследовании безопасности и иммуногенности аналогов инсулина (Гларгин).

Заключение

Заключение. Разработана и валидирована методика определения антител к инсулину в K2EDTA плазме крови человека с помощью тестсистемы на основе клеточной линии iLiteTM Insulin Assay Ready Cells; в основе метода лежит оценка связывания альфа цепи инсулина с высокоаффинным гетеродимерным рецептором CD220.

Introduction

Introduction. IImmunogenicity identification of therapeutic proteins, such as human insulin analogues, is one of the most relevant and significant area in medicine and pharmaceuticals. Determination the possibility of producing neutralizing antibodies to insulin reducing the therapeutic effect of the drug, is an important step to understand the pharmacological profile of the drug. Applying of cell-based methods one allows to determinate neutralizing antibodies to insulin.

Aim

Aim. Development and validation methods for detection of neutralizing antibodies against insulin in human plasma.

Materials and methods

Materials and methods. The method is based on the use of the iLiteTM Insulin Assay Ready Cells [1], in the genome of which the firefly luciferase reporter gene is introduced under the control of an insulin-dependent promoter. As the insulin concentration increases, the firefly luciferase expression (Firefly) increases, allowing one to use this cell line to estimate the number of neutralizing antibodies against insulin. For normalization by the number of cells and considering the matrix effect of studied samples, the second reporter gene luciferase Renilla is used, which is expressed under the control of a constitutive promoter. The activity of both luciferases was measured using the DualGlo Luciferase Assay System (Promega) assay [2].

Results and discussion

Results and discussion. Optimal insulin concentration and plasma/serum dilution were determined to identify neutralizing antibodies to insulin. The long-term stability of neutralizing antibodies to insulin were shown in human plasma for more than 3 months. The developed method was applied in a comparative research of the safety and immunogenicity of insulin analogues (Glargine). Method for the determination of antibodies to insulin was.

Conclusion

Conclusion. A method for determination of neutralizing antibodies to insulin in human K2EDTA plasma was developed and validated using iLiteTM Insulin Assay Ready Cells system; based on the binding of the insulin alpha chain to the high-affinity heterodimeric CD220 receptor.

нейтрализующие антителаинсулин Гларгинклеточные методывалидацияneutralizing antibodiesinsulin glarginecell-based methodsvalidationReferencesiLiteTM Insulin Assay Ready Cells (REF: BM3060), Product specification (Euro Diagnostica AB, Doc No: E-165-GB01). Available at: https://www.eurodiagnostica.com/downloadFile.php?fileName=upload/files/fileLibrary/BM3060%20Product%20Specification%20iLite%20Insulin%20Assay%20Ready%20Cells%20LABEL-DOC-0362%20v1%200.pdf.Dual-GloR Luciferase Assay System Technical Manual (Promega) Available at: https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/0/dual-luciferase-reporter-assaysystem-protocol.pdf?la=en.Dual-GloR Luciferase Assay System Technical Manual (Promega) Available at: https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/0/dual-luciferase-reporter-assaysystem-protocol.pdf?la=en.iLiteTM Insulin Assay Ready Cells (REF: BM3060), Product specification (Euro Diagnostica AB, Doc No: E-165-GB01). Available at: https://www.eurodiagnostica.com/downloadFile.php?fileName=upload/files/fileLibrary/BM3060%20Product%20Specification%20iLite%20Insulin%20Assay%20Ready%20Cells%20LABEL-DOC-0362%20v1%200.pdf.Аметов А. С., Карпова Е. В. Современный взгляд на инсулинотерапию у больных сахарным диабетом 2 типа в ежедневной клинической практике врача-эндокринолога. Эндокринология. 2008; 495: 71–5.Ametov A. S., Karpova E. V. A modern view on insulin therapy in patients with type 2 diabetes in the daily clinical practice of an endocrinologist. Endokrinologiya. 2008; 495: 71–5 (in Russ.).Авакова К. А. Оптимизация методов современной инсулинотерапии при лечении сахарного диабета. Авторефеф дисс. канд. мед. наук. 2009.Avakova K. A. Optimization of methods of modern insulin therapy in the treatment of diabetes. PhD thesis. 2009 (in Russ.).McKeage K., Goa K. L. Insulin glargine. Drugs. 2001; 61(11): 1599–1624. https://doi.org/10.2165/00003495-200161110-00007.McKeage K., Goa K. L. Insulin glargine. Drugs. 2001; 61(11): 1599–1624. https://doi.org/10.2165/00003495-200161110-00007.Davies M., Dahl D., Heise T., Kiljanski J., Mathieu C. Introduction of biosimilar insulins in Europe. Diabetic Medicine. 2017; 34(10): 1340– 1353. https://doi.org/10.1111/dme.13400.Davies M., Dahl D., Heise T., Kiljanski J., Mathieu C. Introduction of biosimilar insulins in Europe. Diabetic Medicine. 2017; 34(10): 1340– 1353. https://doi.org/10.1111/dme.13400.European Medicines Agency. Abasaglar Insulin Glargine. EPAR Summary for the Public, 2014. Available at: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_Summary_for_thepublic/human/002835/WC500175384.pdf.European Medicines Agency. Abasaglar Insulin Glargine. EPAR Summary for the Public, 2014. Available at: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_Summary_for_thepublic/human/002835/WC500175384.pdf.Determination of anti-Insulin neutralizing antibodies using iLiteTM Insulin Assay Ready Cells, Application note (Euro Diagnostica AB, Doc No: E-183-GB00). Available at: https://www.eurodiagnostica.com/downloadFile.php?fileName=upload/files/fileLibrary/Application%20note%20-%20Determination%20of%20antiinsulin%20neutralizing%20antibodies%20LABEL-DOC-0390%20v1%200.pdf.Determination of anti-Insulin neutralizing antibodies using iLiteTM Insulin Assay Ready Cells, Application note (Euro Diagnostica AB, Doc No: E-183-GB00). Available at: https://www.eurodiagnostica.com/downloadFile.php?fileName=upload/files/fileLibrary/Application%20note%20-%20Determination%20of%20antiinsulin%20neutralizing%20antibodies%20LABEL-DOC-0390%20v1%200.pdf.Quantification of Insulin using iLiteTM Insulin Assay Ready Cells, Application note (Euro Diagnostica AB, Doc No: E-182-GB00). Available at: https://www.eurodiagnostica.com/downloadFile.php?fileName=upload/files/fileLibrary/Application%20note%20-%20Quantification%20of%20Insulin%20LABEL-DOC-0389%20v1%200.pdf.Quantification of Insulin using iLiteTM Insulin Assay Ready Cells, Application note (Euro Diagnostica AB, Doc No: E-182-GB00). Available at: https://www.eurodiagnostica.com/downloadFile.php?fileName=upload/files/fileLibrary/Application%20note%20-%20Quantification%20of%20Insulin%20LABEL-DOC-0389%20v1%200.pdf.FDA/CDER/CBER. Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products – Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection Guidance for Industry. FDA. 2019.FDA/CDER/CBER. Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products – Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection Guidance for Industry. FDA. 2019.Home P., Derwahl K.-M., Ziemen M., Wernicke-Panten K., Pierre S., Kirchhein Y., Garg S. K. Anti-Insulin Antibodies and Adverse Events with Biosimilar Insulin Lispro Compared with Humalog Insulin Lispro in People with Diabetes. Diabetes Technol. Ther. 2018; 20: 160–170. https://doi.org/10.1089/dia.2017.0373.Home P., Derwahl K.-M., Ziemen M., Wernicke-Panten K., Pierre S., Kirchhein Y., Garg S. K. Anti-Insulin Antibodies and Adverse Events with Biosimilar Insulin Lispro Compared with Humalog Insulin Lispro in People with Diabetes. Diabetes Technol. Ther. 2018; 20: 160–170. https://doi.org/10.1089/dia.2017.0373.Chatterjee S., Vashishta L., Waichale V. S., Nayak V. G., Melarkode R., Donnelly C. M., Sengupta N. Development and validation of a cellbased assay for the detection of neutralizing antibodies against recombinant insulins. J. Immunol. Methods. 2017 (452): 53–62. doi:10.1016/j.jim.2017.09.004.Chatterjee S., Vashishta L., Waichale V. S., Nayak V. G., Melarkode R., Donnelly C. M., Sengupta N. Development and validation of a cellbased assay for the detection of neutralizing antibodies against recombinant insulins. J. Immunol. Methods. 2017; 452: 53–62. doi:10.1016/j.jim.2017.09.004.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.