pharmjournalРазработка и регистрация лекарственных средствDrug development & registration2305-20662658-5049LLC «CPHA»10.33380/2305-2066-2019-8-4-9-15pharmjournal-723Research ArticleПОИСК И РАЗРАБОТКА НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВRESEARCH AND DEVELOPMENT OF NEW DRUG PRODUCTSИсследование противовирусной активности экспериментальных образцов препаратов, полученных из травы и корней Alchemilla vulgaris L. в отношении вирусов осповакцины и оспы мышейInvestigation of the Antiviral Activity of Experimental Samples Obtained from the Grass and Roots of Alchemilla vulgaris L. Against Vaccinia Virus and Ectromelia VirusМазурковаН. А.MazurkovaN. A.

630559, Новосибирская область, р.п. Кольцово

w.v. Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

mazurkova@vector.nsc.ruПроценкоМ. А.ProtsenkoM. A.

630559, Новосибирская область, р.п. Кольцово

w.v. Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

protsenko_ma@vector.nsc.ruФилипповаЕ. И.FilippovaE. I.

630559, Новосибирская область, р.п. Кольцово

w.v. Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

filippova_ei@vector.nsc.ruКукушкинаТ. А.KukushkinaT. A.

630090, г. Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101

101, Zolotodolinskaya str., Novosibirsk, 630090

kukushkina-phyto@yandex.ruВысочинаГ. И.VysochinaG. I.

630090, г. Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101

101, Zolotodolinskaya str., Novosibirsk, 630090

vysochina_galina@mail.ruЛобановаИ. Е.LobanovaI. E.

630090, г. Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101

101, Zolotodolinskaya str., Novosibirsk, 630090

irevlob@ngs.ruМазурковО. Ю.MazurkovO. Yu.

630559, Новосибирская область, р.п. Кольцово

w.v. Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

mazurkov_oyu@vector.nsc.ruШишкинаЛ. Н.ShishkinaL. N.

630559, Новосибирская область, р.п. Кольцово

w.v. Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

shish@vector.nsc.ruАгафоновА. П.AgafonovA. P.

630559, Новосибирская область, р.п. Кольцово

w.v. Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

agafonov@vector.nsc.ruФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"» Роспотребнадзора (ГНЦ ВБ «Вектор»)State Research Center of Virology and Biotechnology VECTORФГБУН «Центральный сибирский ботанический сад СО РАН»Central Siberian Botanical Garden SB RAS20191311201984915Copyright © Мазуркова Н.А., Проценко М.А., Филиппова Е.И., Кукушкина Т.А., Высочина Г.И., Лобанова И.Е., Мазурков О.Ю., Шишкина Л.Н., Агафонов А.П., 20192019Мазуркова Н.А., Проценко М.А., Филиппова Е.И., Кукушкина Т.А., Высочина Г.И., Лобанова И.Е., Мазурков О.Ю., Шишкина Л.Н., Агафонов А.П.Mazurkova N.A., Protsenko M.A., Filippova E.I., Kukushkina T.A., Vysochina G.I., Lobanova I.E., Mazurkov O.Y., Shishkina L.N., Agafonov A.P.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmjournal.ru/jour/article/view/723Введение

Введение. Отмена вакцинации против натуральной оспы после ее ликвидации в 1980 году привела к снижению противооспенного иммунитета у людей. Близкие по структуре к вирусу натуральной оспы зоонозые вирусы оспы обезьян, верблюдов, буйволов и коров тоже представляют опасность для человека. В России на сегодняшний день отсутствуют эффективные и безопасные лекарственные средства для профилактики и лечения натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека и животных. Манжетка обыкновенная (Alchemilla vulgaris) является перспективным источником для разработки новых противовирусных препаратов. Проведенные ранее исследования показали, что водные растворы сухого этанольного извлечения из надземной части и этилацетатного извлечения из корней Alchemilla vulgaris проявляют активность в отношении вируса гриппа и вируса простого герпеса.

Цель

Цель. Цель данной работы заключалась в исследовании химического состава и противовирусной активности экстрактов из корней и травы Alchemilla vulgaris в отношении ортопоксвирусов.

Материалы и методы

Материалы и методы. Качественный анализ образцов экстрактов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Количественный анализ проводили, используя комплекс спектрофотометрических методов. Определение токсичности и противовирусной активности препаратов на основе Alchemilla vulgaris in vitro проводили на перевиваемой культуре клеток Vero. Противовирусную активность полученных препаратов оценивали по снижению инфекционности (титра) ортопоксвирусов в монослое клеток Vero, зараженных ортопоксвирусами в присутствии препаратов с различной концентрацией, относительно культуры клеток, зараженной ортопоксвирусами без препаратов.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Показано, что образец препарата, полученный методом этилацетатного извлечения из корней исследуемого растения и очищенный хлороформом, содержит в основном катехины и лейкоантоцианы (70 %). В то же время очищенный хлороформом этанольный экстракт из сырой массы травы растения содержит сумму флавоноидов (71 %). При этом содержание флавоноидов в неочищенных этанольных экстрактах из корней и травы Alchemilla vulgaris составляло 5 % и 6 % соответственно. Выявлено, что противовирусную активность в отношении вирусов осповакцины и оспы мышей проявили очищенные препараты, полученные из корней Alchemilla vulgaris при использовании в качестве экстрагента этилацетата, а также препараты, полученные из травы путем этанольного извлечения.

Заключение

Заключение. Таким образом, очищенные этилацетатные экстракты из корней и этанольные экстракты из сырой массы травы Alchemilla vulgaris проявляют противовирусную активность в отношении ортопоксвирусов in vitro. 

 

 

Introduction

Introduction. The abolition of smallpox vaccination after its elimination in 1980 led to a decrease in the immunocompromised immunity in humans. Zoonotic monkeypox, camelpox, buffalopox and cowpox viruses that are close to the variola virus also pose a danger to humans. In Russia today there are no effective and safe medicines for the prevention and treatment of smallpox and other orthopoxvirus infections in humans and animals. The Lady's mantle (Alchemilla vulgaris) is a promising source for the development of new antiviral drugs. Previous studies have found that Alchemilla vulgaris shows activity against influenza virus and herpes simplex virus.

Aim

Aim. The aim of this work was to study the chemical composition and antiviral activity of extracts from the roots and the grass of Alchemilla vulgaris against orthopoxviruses.

Materials and methods

Materials and methods. Qualitative analysis of the samples was performed by high performance liquid chromatography. Quantitative analysis was performed using a complex of spectrophotometric methods. To determine the toxicity and antiviral activity of experimental samples from Alchemilla vulgaris in vitro, a transplantable Vero cell culture was used. Antiviral activity of the obtained preparations was evaluated by reducing the infectivity (titer) of orthopoxviruses in the monolayer of Vero cells infected with orthopoxviruses in the presence of preparations with different concentrations relative to the cell culture infected with orthopoxviruses without the preparations.

Results and discussion

Results and discussion. It was shown that the experimental sample from Alchemilla vulgaris obtained by the method of ethyl acetate extraction from the roots of the studied plant and purified with chloroform contains mainly catechins and leucoanthocyanins (70 %). In parallel, extract from the raw mass of the grass of the plant purified with chloroform and ethanol contains the amount of flavonoids (71 %). Wherein the content of flavonoids in unpurified ethanol extracts from the roots and the grass of Alchemilla vulgaris composed 5 % and 6 %, respectively. It was revealed that purified preparations obtained from Alchemilla vulgaris roots when using ethyl acetate and ethanol as extractants showed antiviral activity against vaccinia virus and ectromelia virus, as well as preparations obtained from grass by ethanol extraction.

Conclusion

Conclusion. Thus, purified ethyl acetate extracts from the roots and ethanol extracts from the wet grass mass of Alchemilla vulgaris exhibit antiviral activity against orthopoxviruses in vitro. 

 

 

Alchemilla vulgarisфлавоноидыкатехинылейкоантоцианывирус осповакцинывирус оспы мышейAlchemilla vulgarisflavonoidscatechinsleucoanthocyaninsVaccinia virusEctromelia virusРабота выполнена в рамках государственного задания ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и государственного задания ЦСБС СО РАН № АААА-А17-117012610051-5 по проекту «Оценка морфогенетического потенциала популяций растений Северной Азии экспериментальными методами».ReferencesБорисевич С. В., Маренникова С. С., Махлай А. А. Терентьев А. И., Логинова С. Я., Перекрест В. В., Краснянский В. П., Бондарев В. П., Рыбак С. И. Оспа обезьян: особенности распространения после отмены обязательного оспопрививания. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012; 2: 69–73.Borisevich S. V., Marennikova S. S., Makhlai A. A., Terentiev A. I., Loginova S. Ya., Perekrest V. V., Krasnyansky V. P., Bondarev V. P., Rybak S. I. Monkeypox: features of spread after cancellation of mandatory pox immunization. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2012; 2: 69–73 (in Russ.).Parker S., Chen N. G., Foster S. et al. Evaluation of disease and viral biomarkers as triggers for therapeutic intervention in respiratory mousepox – an animal model of smallpox. Antiviral Research. 2012: 94(1): 44–53.Parker S., Chen N. G., Foster S. et al. Evaluation of disease and viral biomarkers as triggers for therapeutic intervention in respiratory mousepox – an animal model of smallpox. Antiviral Research. 2012: 94(1): 44–53.Yang G., Pevear D. C., Davies M. H. et al. An Orally Bioavailable Antipoxvirus Compound (ST-246) Inhibits Extracellular Virus Formation and Protects Mice from Lethal orthopoxvirus Challenge. Journal of Virology. 2005: 79(20): 13139–13149.Yang G., Pevear D. C., Davies M. H. et al. An Orally Bioavailable Antipoxvirus Compound (ST-246) Inhibits Extracellular Virus Formation and Protects Mice from Lethal orthopoxvirus Challenge. Journal of Virology. 2005: 79(20): 13139–13149.Grosenbach D. W., Honeychurch K., Rose E. A., Chinsangaram, J., Frimm A., Maiti B., Lovejoy C., Meara I., Long P., Hruby D. E. Oral tecovirimat for the treatment of smallpox. New England Journal of Medicine. 2018; 379: 44–53.Grosenbach D. W., Honeychurch K., Rose E. A., Chinsangaram, J., Frimm A., Maiti B., Lovejoy C., Meara I., Long P., Hruby D. E. Oral tecovirimat for the treatment of smallpox. New England Journal of Medicine. 2018; 379: 44–53.Parker S., Touchette E., Oberle C., Almond M., Robertson A., Trost L. C., Lampert B., Painter G., Buller R. M. Efficacy of therapeutic intervention with an oral ether–lipid analogue of cidofovir (CMX001) in a lethal mousepox model. Antiviral Res., 2008; 77(1): 39–49.Parker S., Touchette E., Oberle C., Almond M., Robertson A., Trost L. C., Lampert B., Painter G., Buller R. M. Efficacy of therapeutic intervention with an oral ether–lipid analogue of cidofovir (CMX001) in a lethal mousepox model. Antiviral Res. 2008; 77(1): 39–49.Rice A. D., Adams M. M., Wallace, G. et al. Efficacy of CMX001 as a post exposure antiviral in New Zealand white rabbits infected with rabbitpox virus, a model for orthopoxvirus infections of humans. Viruses. 2011; 3: 47–62.Rice A. D., Adams M. M., Wallace, G. et al. Efficacy of CMX001 as a post exposure antiviral in New Zealand white rabbits infected with rabbitpox virus, a model for orthopoxvirus infections of humans. Viruses. 2011; 3: 47–62.Mazurkov O. Yu., Kabanov A. S., Shishkina L. N., Sergeev Al. А., Skarnovich M. O., Bormotov N. I., Skarnovich M. A., Ovchinnikova A. S., Titova K. A., Galahova D. O., Bulychev L. Ye., Sergeev A. A., Taranov O. S., Selivanov B. A., Tikhonov A. Ya., Zavjalov E. L., Agafonov A. P., Sergeev A. N. The new effective chemically synthesized anti-smallpox compound NIOCH-14. Journal of General Virology. 2016; 97: 1229–1239. Doi:10.1099/jgv.0.000422.Mazurkov O. Yu., Kabanov A. S., Shishkina L. N., Sergeev Al. А., Skarnovich M. O., Bormotov N. I., Skarnovich M. A., Ovchinnikova A. S., Titova K. A., Galahova D. O., Bulychev L. Ye., Sergeev A. A., Taranov O. S., Selivanov B. A., Tikhonov A. Ya., Zavjalov E. L., Agafonov A. P., Sergeev A. N. The new effective chemically synthesized anti-smallpox compound NIOCH-14. Journal of General Virology. 2016; 97: 1229–1239. Doi:10.1099/jgv.0.000422.Damon I., Karem K., Olson V. Use of live variola virus to evaluate antiviral agents // WHO Advisory Committee on Variola Virus Research Report of the Thirteenth Meeting, Geneva, Switzerland, 31 Oct. – 1 Nov. 2011: 23–24.Damon I., Karem K., Olson V. Use of live variola virus to evaluate antiviral agents // WHO Advisory Committee on Variola Virus Research Report of the Thirteenth Meeting, Geneva, Switzerland, 31 Oct. – 1 Nov. 2011: 23–24.Arndt W., Mitnik C., Denzler K.L., White S., Waters R. Jacobs B. L., Rochon Y., Olson V. A., Damon I. K., Langland J. O. In vitro Characterization of a Nineteenth-Century Therapy for Smallpox // PLoS ONE. 2012; 7(3): e32610. Doi:10.1371/journal.pone.0032610.Arndt W., Mitnik C., Denzler K.L., White S., Waters R. Jacobs B. L., Rochon Y., Olson V. A., Damon I. K., Langland J. O. In vitro Characterization of a Nineteenth-Century Therapy for Smallpox // PLoS ONE. 2012; 7(3): e32610. Doi:10.1371/journal.pone.0032610.Bhanuprakash V., Hosamani M., Balamurugan V., Gandhale P., Naresh R., Swarup D., Singh R. K. In vitro antiviral activity of plant extracts on goatpox virus replication. Indian Journal of Experimental Biology. 2008; 46: 120–127.Bhanuprakash V., Hosamani M., Balamurugan V., Gandhale P., Naresh R., Swarup D., Singh R. K. In vitro antiviral activity of plant extracts on goatpox virus replication. Indian Journal of Experimental Biology. 2008; 46: 120–127.Dimins F., Mikelsone V., Kaneps M. Antioxidant characteristics of Latvian herbal tea types. Proceedings of the Latvian Academy of Sciences, Section B: Natural, Exact and Applied Sciences. 2013; 67(4/5): 433–436. DOI:10.2478/prolas-2013-0067.Dimins F., Mikelsone V., Kaneps M. Antioxidant characteristics of Latvian herbal tea types. Proceedings of the Latvian Academy of Sciences, Section B: Natural, Exact and Applied Sciences. 2013; 67(4/5): 433–436. DOI:10.2478/prolas-2013-0067.Jayanegara A., Marquardt S., Kreuzer M., Leiber F. Nutrient and energy content, in vitro ruminal fermentation characteristics and methanogenic potential of alpine forage plant species during early summer. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2011; 91(10): 1863–1870. DOI:10.1002/jsfa.4398.Jayanegara A., Marquardt S., Kreuzer M., Leiber F. Nutrient and energy content, in vitro ruminal fermentation characteristics and methanogenic potential of alpine forage plant species during early summer. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2011; 91(10): 1863–1870. DOI:10.1002/jsfa.4398.Shrivastava R., John G. Treatment of aphthous stomatitis with topical Alchemilla vulgaris in glycerine. Clinical Drug Investigation. 2006; 26(10): 567–573. DOI:10.2165/00044011-200626100-00003.Shrivastava R., John G. Treatment of aphthous stomatitis with topical Alchemilla vulgaris in glycerine. Clinical Drug Investigation. 2006; 26(10): 567–573. DOI:10.2165/00044011-200626100-00003.Вайс Р. Ф., Финтельманн Ф. Фитотерапия. Руководство. Пер. с нем. Ю. Коршикова. М.: Медицина. 2004: 552.Vajs R. F., Fintelmann F. Herbal medicine. Leadership. Translation from German Yu. Korshikova. M.: Medicine. 2004: 552 (in Russ.).Мазуркова Н. А., Кукушкина Т. А., Высочина Г. И., Ибрагимова Ж. Б., Лобанова И. Е., Филиппова Е. И., Мазурков О. Ю., Макаревич Е. В., Шишкина Л. Н., Агафонов А. П. Изучение противогерпетической активности экстрактов манжетки обыкновенной (Alchemilla vulgaris L.). Разработка и регистрация лекарственных средств. 2016; 1(14): 118–127.Mazurkova N. A., Kukushkina T. A., Vysochina G. I., Ibragimova Zh. B., Lobanova I. Ye., Filippova Ye. I., Mazurkov O. Yu., Makarevich Ye. V., Shishkina L. N., Agafonov A. P. Study of antiherpetic activity of lady’s mantle (Alchemilla vulgaris l.) extracts. Drug development & registration. 2016; 1(14): 118–127 (in Russ.).Филиппова Е. И., Кукушкина Т. А., Лобанова И. Е., Высочина Г. И., Мазуркова Н. А. Противовирусные свойства препарата на основе суммы флавоноидов манжетки обыкновенной (Alchemilla vulgaris L.) в отношении вируса гриппа. Фундаментальные исследования. 2015; 2: 5139–5144.Filippova E. I., Kukushkina T. A., Lobanova I. E., Vysochina G. I., Mazurkova N. A. Antiviral properties based drug total flavonoids lady’s mantle (Alchemilla vulgaris L.) against influenza virus. Fundamental research. 2015; 2: 5139–5144 (in Russ.).Проценко М. А., Костина Н. Е., Теплякова Т. В. Подбор питательных сред для глубинного культивирования дереворазрушающего гриба Daedaleopsis tricolor (Bull.) Bondartsev et Singer. Биотехнология. 2018: 34(1): 45–51.Protsenko M. A., Kostina N. E., Teplyakova T. V. Selection of Nutrient Media for Submerged Culturing of Wood-Destroying Mushroom of Daedaleopsis tricolor (Bull.) Bondartsev et Singer. Biotechnology. 2018; 34(1): 45–51 (in Russ.).Патент РФ № 2128516. Способ получения Р-витаминного средства / Т. А. Кукушкина, Т. А. Жанаева, А. А Зыков, Л. А. Обухова, В. Г. Селятитская. 1999.RF patent No. 2128516. The method of obtaining P-vitamin funds / T. A. Kukushkina, T. A. Zhanaev, A. A. Zykov, L. A. Obukhova, V. G. Selyatitskaya. 1999 (in Russ.).Беликов В. В., Шрайбер М. С. Методы анализа флавоноидных соединений. Фармация. 1970; 1: 66–72.Belikov V. V., Shrajber M. S. Methods of analysis of flavonoid compounds. Farmaciya. 1970: 1: 66–72 (in Russ.).Кукушкина Т. А., Зыков А. А., Обухова Л. А. Манжетка обыкновенная (Alchemilla vulgaris L.) как источник лекарственных средств. Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения. Фитофарм. 2003: 64–69.Kukushkina T. A., Zykov A. A., Obuhova L. A. Common cuff (Alchemilla vulgaris L.) as a source of medicines. Actual problems of creating new drugs of natural origin. Fitofarm. 2003: 64–69. (in Russ.).Федосеева Л. М. Изучение дубильных веществ подземных и надземных органов бадана толстолистного (Bergenia crassifolia (L.) Fitsch.), произрастающего на Алтае. Химия растительного сырья. 2005; (2): 45–50.Fedoseeva L. M. The study of tannins of underground and aboveground vegetative organs of the Bergenia Crassifolia (L.) Fitsch., growing in Altai. Chemistry of plant raw material. 2005; (2): 45–50 (in Russ.).Закс Л. Статистическое оценивание. Статистика. 1976: 598.Zaks L. Statistical evaluation. Statistika. 1976: 598 (in Russ.).Muhammad A., Guerrero-Analco J. A., Martineau L. C., Musallam L., Madiraju P., Nachar A., Saleem A., Haddad P. S., Arnason J. T. Antidiabetic compounds from Sarracenia purpurea used traditionally by the Eeyou Istchee Cree First Nation. J. Nat. Prod. 2012; 75(7): 1284– 1288. Doi:10.1021/np3001317.Muhammad A., Guerrero-Analco J. A., Martineau L. C., Musallam L., Madiraju P., Nachar A., Saleem A., Haddad P. S., Arnason J. T. Antidiabetic compounds from Sarracenia purpurea used traditionally by the Eeyou Istchee Cree First Nation. J. Nat. Prod. 2012; 75(7): 1284– 1288. Doi:10.1021/np3001317.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.