Разработка таблеток для приема внутрь на основе дигидрокверцетина и оценка их общетоксического действия

Введение. Дигидрокверцетин – флавоноид, обладающий широким спектром фармакологической активности. Установлен его позитивный терапевтический профиль при хронической венозной недостаточности, хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астме, для предупреждения инсульта. Его использование приводит к улучшению течения атеросклероза и болезни Альцгеймера. Кроме того, для него характерны радиопротекторное, противовоспалительное, противоаллергическое, репаративное, гепатопротекторное действия. В настоящее время лекарственных препаратов, содержащих дигидрокверцетин, на отечественном фармацевтическом рынке нет. Однако выраженный терапевтический потенциал дигидрокверцетина экономическая и технологическая доступность его субстанции свидетельствуют об актуальности разработки лекарственных форм на основе настоящей молекулы.

Цель. Разработка оптимального состава и технологии таблеток на основе дигидрокверцетина и оценка их физико-химических свойств, общетоксического действия и безопасности.

Материалы и методы. Таблетки получали методом прямого прессования на лабораторном роторном прессе XS press (Robert Bosch Gmbh, Германия). Сыпучесть и насыпную плотность порошков определяли на приборе ERWEKA GT (ERWEKA GmbH, Германия). Испытания таблеток на прочность и геометрические размеры проводили на тестере SOTAX HT1 (SOTAX AG, Швейцария), истираемость таблеток определяли на тестере SOTAX F2 (SOTAX AG, Швейцария), распадаемость определяли на тестере DISI-A Touch (CHARLES ISCHI AG, Швейцария). Использована субстанция дигидрокверцетина компании ООО «Химия Древесины». В качестве вспомогательных веществ использовали силикатированную целлюлозу, предназначенную для прямого прессования, аэросил 200, натрия крахмала гликолят и магния стеарат. Качественное и количественное содержание дигидрокверцетина в таблетках определяли с использованием ВЭЖХ-УФ (Agilent 1260 Infinity II). Таблетки растворяли в определенном объеме подвижной фазы, а затем фильтровали раствор (0,22 мкм шприцевые фильтры PTFE, VWR, США). Использовали следующие реактивы: ацетонитрил для хроматографии и кислоту фосфорную концентрированную, ч.д.а., ГФ РФ XIV, ОФС.1.3.0001.15 «Реактивы. Индикаторы». Подвижную фазу А получали растворением 40 мл ацетонитрила в воде очищенной. В качестве подвижной фазы Б использовали 1%-й раствор фосфорной кислоты. Хроматографирование пробы объемом 10 мкл в течение 30 мин осуществляли на колонке Luna C18 150 × 4,6 мм, размер частиц 5 мкм при температуре колонки 35 °С, скорости потока – 1 мл/мин. Использовали УФ-детектор, 290 нм. Градиентные условия: время, мин – 0; подвижная фаза А-80; подвижная фаза Б-20. Определение острой, подострой токсичности и местно-раздражающего действия проводили по общепринятой методике согласно ГФ РФ ХIV на половозрелых самцах и самках белых мышей и крыс в лаборатории патоморфологии и лекарственной токсикологии ЦКП (НОЦ) РУДН. Исследование проводили на 36 здоровых половозрелых аутбредных мышах с массой тела 18–20 г и на 30 здоровых половозрелых аутбредных крысах массой тела 180–200 г. Изучаемые таблетки вводили животным однократно внутрижелудочно при помощи атравматичного зонда в виде суспензии, приготовленной на 1%-й крахмальной слизи. Препаратом сравнения служила 1%-я крахмальная слизь. Длительность наблюдения за лабораторными животными составляла 14 дней при исследовании острой токсичности и 30 дней при оценке подострой. Ежедневно проводили клинический осмотр животных, оценивали физиологические показатели, фиксировали состояние. Выбор доз осуществлялся согласно уже имеющимся данным о токсичности требованиям, описанным в нормативной документации OESD № 425. Подробный клинический осмотр животного осуществляется в клетке содержания, в руках и на открытой площадке. Отмечали проявление и выраженность, где приемлемо, признаков интоксикации. Частота осмотра зависела от выраженности картины интоксикации, но не реже чем на 2-й, 7-й и 14-й день эксперимента. Масса тела регистрировалась непосредственно перед введением на 2-е, 7-е сутки и непосредственно перед эвтаназией. Ежедневно визуально регистрировались отклонения в потреблении животными корма и воды в групповых посадочных клетках. Лишение корма производилось в ночь перед эвтаназией. Животные лишались корма, но не воды. Животных подвергали эвтаназии помещением в эксикационную камеру с эфиром через 14 дней после введения изучаемого препарата и препарата сравнения.

Результаты и обсуждение. Определены технологические характеристики субстанции дигидрокверцетина для реализации технологического процесса изготовления таблеток на его основе. Установлено, что субстанция дигидрокверцетин имеет очень плохую сыпучесть. Для улучшения технологических свойств субстанции использовались 4 вида вспомогательных веществ, позволяющие улучшить технологические свойства действующего вещества. Подобраны условия хроматографирования для определения дигидрокверцетина в таблетках методом ВЭЖХ-УФ. Определена летальная доза при однократном введении, оценены токсические эффекты при многократном повторном введении препарата «дигидрокверцетин» в лекарственной форме таблетки для приема внутрь. На лабораторных животных оценено местно-раздражающее действие препарата при пероральном применении. В ходе проведенных экспериментов установлено отсутствие местно-раздражающего действия при применении таблеток на основе дигидрокверцетина, при определении класса токсичности препарат отнесен к III классу «умеренно токсичных» веществ. На основании результатов субхронического эксперимента можно рассчитать индекс безопасности (ИБ) воспроизведенного препарата «Дигидрокверцетин, таблетки 20 мг» при применении в клинике в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Заключение. В результате проведенных исследований разработаны состав и технология таблеток на основе дигидрокверцетина. Установлено, что оптимальная композиция для изготовления таблеток с дигидрокверцетином методом прямого прессования должна содержать наполнитель силикатированную целлюлозу, натрия крахмала гликолят, глидант аэросил и скользящий агент – магния стеарат. В ходе таблетирования подобраны режимы прессования. Оптимальная сила прессования – 5 кН. Глубина наполнения составила – 7 мм. Оптимальное разведение пуансонов оказалось равным 2,5 мм. Скорость ротора была постоянной и составляла 15 об/мин. Скорость работы питателя 25 об/мин. Разработана и валидирована методика ВЭЖХ-УФ для идентификации и определения количественного содержания дигидрокверцетина в таблетках. Показано, что на хроматограмме таблеток помимо основного пика определяются пики биофлавононов эриодиктиола и кверцетина. Это может способствовать расширению спектра фармакологической активности полученных таблеток. Проведена оценка общетоксического действия и безопасности таблеток дигидрокверцетина. Установлена среднесмертельная доза препарата (LD₅₀), которая при пероральном применении мышам соответствовала 159 мг/кг. Внутрижелудочное применение на протяжении месяца изучаемых таблеток в дозе 100 и 200 мг/кг не вызывает патологических изменений во внутренних органах подопытных животных. При изучении гематологических и биохимических показателей крови, а также массы внутренних органов на различных сроках введения достоверных различий с группой контрольных животных не выявлено.

1. Прозоровский В. Б., Прозоровская М. П., Демченко В. М. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки. Фармакология и токсикология. 1978;41(4):497–502.

2. Christudas S., Baojun X. An insight into the health-promoting effects of taxifolin (dihydroquercetin). Phytochemistry. 2019;166:112066. DOI: 10.1016/j.phytochem.2019.112066.

3. Трахтенберг И. М. Проблемы нормы в токсикологии. М.: Медицина; 1991. 203 с.

4. Бабкин В. А., Остроухова Л. А., Малков Ю. А., Иванова С. З., Онучина Н. А., Бабкин Д. В. Биологически активные вещества древесины лиственницы. Химия в интересах устойчивого развития. 2001;3:363–367.

5. Chen X., Gu N., Xue C, Li B. R. Plant flavonoid taxifolin inhibits the growth, migration and invasion of human osteosarcoma cells. Molecular medicine reports. 2018;17(2):3239–3245. DOI: 10.3892/mmr.2017.8271.

6. Yang C. L., Lin Y. S., Liu K. F., Peng W. H., Hsu C. M. Hepatoprotective mechanisms of taxifolin on carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice. Nutrients. 2019;11:2655. DOI: 10.3390/nu11112655.

7. Yoon K. D., Lee J. Y., Kim T. Y., Kang H., Ha K. S., Ham T. H., Ryu S. N., Kang M. Y., Kim Y. H., Kwon Y. I. In vitro and in vivo anti-hyperglycemic activities of taxifolin and its derivatives isolated from pigmented rice (Oryzae sativa L. cv. Superhongmi). Journal of agricultural and food chemistry. 2020;68(3):742–750. DOI: 10.1021/acs.jafc.9b04962.

8. Topal F., Nar M., Gocer H., Kalin P., Kocyigit U. M., Gülçin İ., Alwasel S. H. Antioxidant activity of taxifolin: an activity-structure relationship. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry. 2016;31(4):674–683. DOI: 10.3109/14756366.2015.1057723.

9. Zhang Y., Yu J., Dong X. D., Ji H. Y. Research on characteristics, antioxidant and antitumor activities of dihydroquercetin and its complexes. Molecules. 2017;23(1):20. DOI: 10.3390/molecules23010020.

10. Гуськова Т. А. Токсикология лекарственных средств. М.: Русский врач; 2003. 133 с.

11. Wang W., Ma B.-L., Xu C.-G., Zhou X.-J. Dihydroquercetin protects against renal fibrosis by activating the Nrf2 pathway. Phytomedicine. 2020;69:1531854. DOI: 10.1016/j.phymed.2020.153185.

12. Государственная фармакопея Российской Федерации. ХIV изд. Т. 3. М.: Министерство здравоохранения Российской Федерации; 2018. 5004 с.