Введение. Исследование производных 1,3-оксазина играет ключевую роль в области химии гетероциклических соединений. Тем не менее в литературе отсутствует систематизированная информация о способах синтеза биспроизводных 1,3-оксазин-6-онов. Создание эффективных методов получения этих оксазинов, а также изучение их структуры, характеристик и биологической активности представляет собой многообещающее направление как для медицинской химии, так и для фармацевтической промышленности.

Цель. Разработать лабораторный способ получения бис(4-гидрокси-6H-1,3-оксазин-6-онов) на основе реакции бензол-1,3-дикарбоксамида и бензол-1,4-дикарбоксамида с замещенными малонилхлоридами и доказать их строение с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на ядрах ¹Н и ¹³С.

Материалы и методы. Спектры ¹H- и ¹³C-ЯМР были зарегистрированы на приборе Bruker AM-600 в дейтерированном диметилсульфоксиде (ДМСО-d6), их обработка осуществлена с помощью программного обеспечения ACD/Labs. Мониторинг протекания реакций проведен с применением тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем TLC Silicagel 60 F₂₅₄ с использованием этилацетата в качестве элюента и детекцией в ультрафиолетовом (УФ) свете. Методика синтеза включала суспендирование 1 ммоль бензол-1,4-дикарбоксамда или бензол-1,3-дикарбоксамида в абсолютном 1,2-дихлорэтане, добавление 2,4 ммоль замещенного малонилхлорида и кипячение смеси в течение 15 ч. Конец реакции определен по отсутствию исходных диамидов в реакционной массе методом тонкослойной хроматографии.

Результаты и обсуждение. В результате исследования был разработан лабораторный метод синтеза бис(4-гидрокси-6H-1,3-оксазин-6-онов) с фениленовыми мостиками между гетероциклическими фрагментами. Использование в качестве растворителя абсолютного 1,2-дихлорэтана позволило увеличить выход целевых соединений на 5–7 % и сократить время синтеза на 5 ч по сравнению с абсолютным бензолом. Строение синтезированных веществ было доказано спектроскопией ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹H и ¹³C. В спектрах полученных соединений присутствуют все характеристичные сигналы, соответствующие бис(4-гидрокси-6Н-1,3-оксазин-6-онам).

Заключение. Разработан, реализован и оптимизирован лабораторный метод синтеза бис(4-гидрокси-6Н-1,3-оксазин-6-онов) на основе реакции бензол-1,3-дикарбоксамида и бензол-1,4-дикарбоксамида с монозамещенными малонилхлоридами. Целевые соединения были получены в абсолютном 1,2-дихлорэтане с выходом, близким к количественному. Это подтверждает эффективность разработанного подхода. Структура всех полученных бис(4-гидрокси-6Н-1,3-оксазин-6-онов) была достоверно установлена с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹H и ¹³C.

Введение. Сверхэкспрессия рецептора HER2 ассоциирована с агрессивным течением онкологических заболеваний и неблагоприятным прогнозом. Традиционная иммуногистохимическая диагностика имеет ряд ограничений, включая инвазивность, невозможность оценки гетерогенности опухоли и тотального распространения процесса. Перспективной альтернативой является радионуклидная визуализация с использованием каркасных таргетных белков DARPin G3. По результатам доклинических исследований препарат ^99mTс[Tc]-G3-(G₃S)₃C был предложен для проведения I фазы клинических исследований. Экспериментальный препарат представляет собой стерильный лиофилизат химического предшественника в одном флаконе и должен соответствовать требованиям ОФС 1.11.0005 «Химические предшественники для радиофармацевтических лекарственных препаратов» и ОФС 1.7.1.0007.15 «Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК» Государственной фармакопеи РФ XV издания.

Цель. Целью настоящего исследования была разработка подходов и методик контроля качества белка DARPin G3-(G₃S)₃C, входящего в состав разработанной композиции лиофилизата химических предшественников для получения ^99mTс-содержащего препарата для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2 в злокачественных опухолях

Материалы и методы. Объектом исследования явился лиофилизат, содержащий DARPin G3-(G₃S)₃C со вспомогательными веществами. Для регистрации масс-спектров белка использовали ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометром, снабженным источником ионизации электрораспылением. Вертикальный электрофорез с натрия додецилсульфатом (SDS) в полиакриламидном геле с концентрацией акриламида 15 % проводили при напряжении 110 В в течение 2 ч. В качестве красящего раствора использовали раствор кумасси В-250. Тандемную масс-спектрометрию проводили с помощью системы ВЭЖХ с масс-спектрометром посредством наноэлектроспрейного источника. При корреляции аминокислотной последовательности карбамидометилирование Cys, деамидирование Asn/Gln и окисление Met учитывались как вариабельные модификации. Для определения количества белка в лиофилизате был использован спектрофотометрический метод при длине волны 280 нм. Валидационная оценка разработанной методики проводилась в соответствии с требованиями ОФС.1.1.0012 «Валидация аналитических методик» Государственной фармакопеи РФ XV издания.

Результаты и обсуждение. Подлинность и чистота DARPin G3-(G₃S)₃C была подтверждена с использованием ВЭЖХ-МС. Молекулярная масса мономера согласуется с расчетной и составила 14075,9 Да с точностью до 0,5 Да, чистота белка была близка к 100 %. Для определения подлинности и чистоты DARPin G3-(G₃S)₃C методом электрофореза в полиакриаламидном геле предложено использовать 2 мкг и 20 мкг белка соответственно. Рассчитанная молекулярная масса белка составила 13,58 ± 0,82 кДа. В лиофилизате содержание примеси гомодимера, определенной электрофорезом в полиакриламидном геле, не превышало 3 %, другие белковые примеси наблюдались в количестве не более 1 %. Чистота белка, установленная методом ВЭЖХ-МС/МС для анализа первичной структуры, составила 98 %. Перекрытие аминокислотной последовательности целевого белка с идентифицированными пептидными фрагментами составило 100 %. В результате анализа гидролизата белка было идентифицировано более 700 его пептидных фрагментов (значение –10LоgP – более 20). Разработанная методика УФ-спектрофотомерии соответствует валидационным требованиям и позволяет определять количественного содержание белка DARPin G3-(G₃S)₃C в лиофилизате ±10 % от номинального содержания.

Заключение. Для определения показателя «подлинность» нового химического предшественника белка DARPin G3-(G₃S)₃C в составе лиофилизата для получения  ^99mTс-содержащего препарата для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2 в злокачественных опухолях были предложены методики масс-спектрометрии, пептидного картирования, электрофорез в полиакриламидном геле. Для показателя «родственные примеси» – методика электрофореза в полиакриламидном геле. Для определения показателя «количественное определение» – методика УФ-спектрофотометрии.