Получение каллусной культуры шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.) и ее характеристика

Введение. Выращивание биомассы растительных клеток как метод получения сырья существует довольно долгое время. Растительные клетки, культивируемые in vitro, выступают в роли источника ценных вторичных метаболитов, таких как фенолы, алкалоиды, фитостероиды, гликозиды и др. Важно создать такие условия, при которых в штаммах будет наблюдаться накопление ценных биологически активных веществ. Культивирование предполагает использование сложных многокомпонентных питательных сред, содержащих определенный набор макро-, микроэлементов, витаминов, стимуляторов роста. Шалфей лекарственный обладает широким спектром фармакологического действия. В связи с ограниченным ареалом произрастания шалфея лекарственного, а также с ухудшением экологической обстановки в регионах произрастания использование фитобиотехнологического метода получения сырья является актуальным.

Цель. Получить жизнеспособную каллусную культуру шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.).

Материалы и методы. В качестве эксплантов использованы листья интактного растения шалфея лекарственного, семейства Яснотковые (Salvia officinalis, Lamiaceae). Предварительную стерилизацию эксплантов осуществляли 6%-м раствором гипохлорита натрия в течение 20 минут и этанолом 70%-м – 1 минуты. Культивировали на питательной среде по прописи Мурасиге – Скуга. Определение жизнеспособности клеток с использованием витальных красителей оценивали при помощи микроскопии (микроскоп цифровой Bresser LCD 50x-2000x, Германия). Высокоэффективную тонкослойную хроматографию проводили с использованием системы HPTLC PRO SYSTEM (CAMAG AG, Швейцария).

Результаты и обсуждение. После двух недель культивирования на поверхности эксплантов наблюдалось образование первичного каллуса. Визуально он представлял собой тонкий слой интенсивно делящихся недифференцированных клеток светло-жёлтого цвета. В течение культивирования нарастала биомасса полученного каллуса, он становился более рыхлым и приобретал более темный оттенок, также начинала темнеть питательная среда. Обнаруженные клетки при микроскопии можно разделить на два типа: первый тип – клетки меристематического типа, второй тип – клетки паренхимного типа. Микроскопия показала, что более 95 % всех визуализированных клеток живые. В следующих пассажах существенных изменений морфотипа культуры отмечено не было. В одиннадцатом пассаже проведено исследование ростовой активности штамма. Максимальная удельная скорость роста 0,42 сут^-1 наблюдается на 14–18 сутки роста, при этом показатель времени удвоения биомассы наименьший и соответствует значению 1,66 суток. За один цикл культивирования количество биомассы увеличивается в 7,73 раза. Результаты качественного анализа методом ВЭТСХ показывают, что качественный состав биомассы шалфея лекарственного в целом близок к таковому у интактных растений.

Заключение. Получен жизнеспособный стабильный штамм растительных клеток шалфея лекарственного на питательной среде по прописи Мурасига и Скуга с половинным содержанием микро- и макросолей и фитогормонами 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (6 мг/мл) и кинетин (1 мг/мл). Для следующих пассажей рекомендовано использование питательной среды по прописи Мурасиге – Скуга с полным содержанием микро- и макросолей и фитогормонами α-нафтилуксусная кислота (1 мг/мл) и кинетин (1 мг/мл). Основную массу полученного гетерогенного каллуса составляют клетки меристематического и паренхимного типа. Качественный состав БАВ биомассы шалфея лекарственного в целом близок к таковому у интактных растений.

1. Espinosa-Leal C. A., Puente-Garza C. A., García-Lara S. In vitro plant tissue culture: means for production of biological active compounds. Planta. 2018;248:1–18. DOI: 10.1007/s00425-018-2910-1.

2. Krasteva G., Georgiev V., Pavlov A. Recent applications of plant cell culture technology in cosmetics and foods. Engineering in Life Sciences. 2021;21:68–76. DOI: 10.1002/elsc.202000078.

3. Kreis W. Exploiting plant cell culture for natural product formation. Journal of Applied Botany and Food Quality. 2019;92:216–225. DOI: 10.5073/JABFQ.2019.092.030.

4. Тихомирова Л. И., Базарнова Н. Г., Ильичева Т. Н., Мартиросян Ю. Ц., Афанасенкова И. В. Получение растительного сырья ириса сибирского (Iris Sibirica L.) методами биотехнологии. Химия растительного сырья. 2018;4:235–245. DOI: 10.14258/jcprm.2018043887.

5. Meychik N., Nikolaeva Y., Kushunina M. Ion-exchange properties of the cell walls isolated from suspension-cultured plant cells. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2017;129(3):493–500. DOI: 10.1007/s11240-017-1194-7.

6. Chirikova N. K., Olennikov D. N., Grigor’ev R. O. Acylquinic Acids, Flavonoids, and Maltol O-Glucoside from Panax vietnamensis. Chemistry of Natural Compounds. 2019;55(6):1161–1163. DOI: 10.1007/s10600-019-02922-1.

7. Каухова И. Е., Басевич А. В., Абросимова О. Н., Вайнштейн В. А. Лекарственные средства растительного происхождения. Технология, составы, стандартизация: монография. Спб.: Издательство Кнорус; 2019. 396 с.

8. Томилова С. В., Ханды М. Т., Кочкин Д. В., Галишев Б. А., Клюшин А. Г., Носов А. М. Влияние синтетических аналогов ауксинов – 2,4-Д и α-НУК – на ростовые и биосинтетические характеристики суспензионной культуры клеток Tribulus terrestris L. Физиология растений. 2020;67(4):389–399. DOI: 10.31857/S001533032004017X.

9. Аминова М. З., Кароматов И. Д. Антибактериальные и противовоспалительные свойства лекарственного растения шалфей. Биология и интегративная медицина. 2018;10:41–55.

10. Алексашина С. А., Макарова Н. В. Сравнительное изучение антиоксидантной активности, фенольных соединений и флавоноидов цветков липы сердцевидной (Tilia cordata Mill.), шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), донника лекарственного (Melilоtus officinаlis L.), листьев смородины (Ribes nigrum folia), земляники лесной (Fragaria vesca L.), винограда (Vitis labrusca), произрастающих в самарском регионе. Химия растительного сырья. 2019;3:153–159. DOI: 10.14258/jcprm.2019034623.

11. Вовк Д. А. Получение каллусной культуры шалфея лекарственного и изучение её ростовой активности. Молодая фармация – потенциал будущего: сб. статей. 2020:487–490.

12. Beckwith A. L., Borenstein J. T., Velásquez-García L. F. Tunable plant-based materials via in vitro cell culture using a Zinnia elegans model. Journal of Cleaner Production. 2021;125571:288. DOI: 10.1016/j.jclepro.2020.125571.

13. Бурмистрова Н. А., Красавина М. С., Лунькова Н. Ф., Паничкин Л. А. Использование Эванса голубого и нейтрального красного для оценки жизнеспособности клеток. Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2017;3:39–51.

14. Volkova L. A., Urmantseva V. V., Burgutin A. B., Nosov A. M. Characteristics of Eliciting Effects of Furostanol Glycosides on Cultured Yam Cells. Russian Journal of Plant Physiology. 2018;65(3):427–434. DOI: 10.1134/S1021443718020085.

15. Хохлова Е. А. Контроль качества растительных препаратов промышленного и аптечного производства с использованием системы ВЭТСХ. Фармацевтическая отрасль. 2016;6(59):82–87.

16. Загоскина Н. В. Биотехнология: теория и практика. М.: Издательство Оникс; 2009. 496 с.