Двойной протеолиз для определения N- и O-гликозилирования Fc-гибридного белка этанерцепта методом пептидного картирования

Введение. Современные биотехнологические препараты представлены преимущественно высокогликозилированными белками. Подавляющее большинство таких препаратов, выпускаемых отечественными биофармацевтическими компаниями, являются биоаналогами зарубежных препаратов. Основа разработки таких препаратов – аналитические исследования, направленные на подтверждение эквивалентности структур биоаналога и эталона. Наибольшую аналитическую сложность представляют Fc-слитые препараты, сочетающие в себе свойства эффекторных белков и кристаллизующегося фрагмента IgG1. Единственным биоаналогом такого вида, зарегистрированным в России, является этанерцепт, который был выбран в качестве объекта исследования. Существующие классические походы не позволяют точно и достоверно определять гликановый профиль таких препаратов. Разработка подходов и принципов таких исследований необходима, так как изменение структуры биоаналога в процессе производства может оказать большое влияние на его эффективность и безопасность.

Цель. Разработка подходов двойного протеолиза, позволяющих провести гликопептидное картирование Fc-слитого белка этанерцепта с использованием протеазы Arg-C.

Материалы и методы. Этанерцепт подвергался энзиматическому гидролизу с применением комбинаций трипсина с одной из двух протеаз (Arg-C или Asp-N). Образующиеся пептиды идентифицировались методом ВЭЖХ-МС/МСВР. Подтверждение структуры гликанов осуществлялось по фрагментным спектрам гликопептидов, полученным в режиме повышенной энергии столкновений (MS^E).

Результаты и обсуждение. Использование комбинации трипсина с Arg-C приводило к надежным результатам. Разработанный подход позволил определить большинство участков О-гликозилирования и установить типы О-гликанов этанерцепта. Показано, что для эффективного О-гликопептидного картирования необходима стадия N-дегликозилирования. N-гликопептидным картированием были идентифицированы основные формы N-гликанов каждого из трех участков N-гликозилирования (N149, N171, N317). Установлено, что применение комбинации трипсина с Arg-C позволяет идентифицировать трехантенные формы, несмотря на наличие в образующемся пептиде участка О-гликозилирования. Общий профиль N-гликозилирования, выраженный как процент от суммарного отклика всех идентифицированных гликоформ, показывает сопоставимость результатов при использовании разработанного подхода.

Заключение. В результате проведенного исследования нами были разработаны подходы гликопептидного картирования, включающие использование комбинаций протеаз, которые позволяют надежно и воспроизводимо определять локализацию участков и формы N- и О-гликозилирования этанерцепта. Разработанные подходы могут использоваться для проведения исследований сопоставимости биоподобных лекарственных средств, оценки качества при изменении технологии производства лекарственных препаратов (ЛП), при разработке новых биотехнологических ЛП.

1. Kostin K. B., Shanava L. A. Key trends in the development of the Russian pharmaceutical market amidst uncertainty. Journal of Economics, Entrepreneurship and Law. 2022;12(5):1639–1658. (In Russ.) DOI: 10.18334/epp.12.5.114635.

2. Fischer S., Hoernschemeyer J., Mahler H.-C. Glycation during storage and administration of monoclonal antibody formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2008;70(1):42–50. DOI: 10.1016/j.ejpb.2008.04.021.

3. Jefferis R. Posttranslational modifications and the immunogenicity of biotherapeutics. Journal of Immunology Research. 2016;2016:5358272. DOI: 10.1155/2016/5358272.

4. Xu Y., Wang D., Mason B., Rossomando T., Li N., Liu D., Cheung J. K., Xu W., Raghava S., Katiyar A., Nowak C., Xiang T., Dong D. D., Sun J., Beck A., Liu H. Structure, heterogeneity and developability assessment of therapeutic antibodies. MAbs. 2019;11(2):239–264. DOI: 10.1080/19420862.2018.1553476.

5. Eon-Duval A., Broly H., Gleixner R. Quality attributes of recombinant therapeutic proteins: an assessment of impact on safety and efficacy as part of a quality by design development approach. Biotechnology Progress. 2012;28(3):608–622. DOI: 10.1002/btpr.1548.

6. Kaur H. Characterization of glycosylation in monoclonal antibodies and its importance in therapeutic antibody development. Critical Reviews in Biotechnology. 2021;41(2):300–315. DOI: 10.1080/07388551.2020.1869684.

7. Goffe B., Cather J. C. Etanercept: An overview. Journal of the American Academy of Dermatology. 2003;49(2):105–111. DOI: 10.1016/mjd.2003.554.

8. Liu L. Antibody glycosylation and its impact on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2015;104(6):1866–1884. DOI: 10.1002/jps.24444.

9. Brockhaus M., Gentz R., Zlatko D., Lesslauer W., Lotscher H., Schlaeger E-J. Human TNF receptor fusion protein. US Patent 8063182. 2011. Available at: https://patents.google.com/patent/US8063182B1/ Accessed: 03.08.2022.

10. Tracey D., Klareskog L., Sasso E. H., Salfeld J. G., Tak P. P. Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review. Pharmacology & Therapeutics. 2008;117(2):244–279. DOI: 10.1016/j.pharmthera.2007.10.001.

11. Gur A., Oktayoglu P. Advances in biologic agents for the treatment of rheumatoid arthritis. Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry. 2010;9(1):24–34. DOI: 10.2174/187152310790711656.

12. Wohlschlager T., Scheffler K., Forstenlehner I. C., Skala W., Senn S., Damoc E., Holzmann J., Huber C. G. Native mass spectrometry combined with enzymatic dissection unravels glycoform heterogeneity of biopharmaceuticals. Nature Communications. 2018;9(1):1713. DOI: 10.1038/s41467-018-04061-7.

13. Fazel R., Guan Y., Vaziri B., Krisp C., Heikaus L., Saadati A., Hidayah S. N., Gaikwad M., Schlüter H. Structural and in vitro functional comparability analysis of Altebrel^TM, a proposed etanercept biosimilar: Focus on primary sequence and glycosylation. Pharmaceuticals. 2019;12(1):14. DOI: 10.3390/ph12010014.

14. Duivelshof B. L., Murisier A., Camperi J., Fekete S., Beck A., Guillarme D., D'Atri V. Therapeutic Fc-fusion proteins: Current analytical strategies. Journal of Separation Science. 2021;44(1):35–62. DOI: 10.1002/jssc.202000765.

15. Zhu L., Guo Q., Guo H., Liu T., Zheng Y., Gu P., Chen X., Wang H., Hou S., Guo Ya. Versatile characterization of glycosylation modification in CTLA4-Ig fusion proteins by liquid chromatography-mass spectrometry. MAbs. 2014;6(6):1474–1485. DOI: 10.4161/mabs.36313.

16. Stavenhagen K., Gahoual R., Dominguez Vega E., Palmese A., Ederveen A. L. H., Cutillo F., Palinsky W., Bierau H., Wuhrer M. Site-specific N- and O-glycosylation analysis of atacicept. MAbs. 2019;11(6):1053–1063. DOI: 10.1080/19420862.2019.1630218.

17. Houel S., Hilliard M., Yu Y. Q., McLoughlin N., Martin S. M., Rudd P. M., Williams J. P., Chen W. N- and O-glycosylation analysis of etanercept using liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry equipped with electron-transfer dissociation functionality. Analytical Chemistry. 2014;86(1):576–584. DOI: 10.1021/ac402726h.

18. Graf T., Heinrich K., Grunert I., Wegele H., Haberger M., Bulau P., Leiss M. Recent advances in LC-MS based characterization of protein-based bio-therapeutics – mastering analytical challenges posed by the increasing format complexity. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2020;186(113251):113251. DOI: 10.1016/j.jpba.2020.113251.

19. Cho I. H., Lee N., Song D., Jung S. Y., Bou-Assaf G., Sosic Z., Zhang W., Lyubarskaya Y. Evaluation of the structural, physicochemical, and biological characteristics of SB4, a biosimilar of etanercept. MAbs. 2016;8(6):1136–1155. DOI: 10.1080/19420862.2016.1193659.

20. Montacir O., Montacir H., Springer A., Hinderlich S., Mahboudi F., Saadati A., Parr M. K. Physicochemical characterization, glycosylation pattern and biosimilarity assessment of the fusion protein Etanercept. The Protein Journal. 2018;37(2):164–179. DOI: 10.1007/s10930-018-9757-y.

21. Kleemann G. R., Beierle J., Nichols A. C., Dillon T. M., Pipes G. D., Bondarenko P. V. Characterization of IgG1 immunoglobulins and peptide-Fc fusion proteins by limited proteolysis in conjunction with LC-MS. Analytical Chemistry. 2008;80(6):2001–2009. DOI: 10.1021/ac701629v.

22. Yu L., Xiao G., Zhang J., Remmele R. L., Eu M., Liu D. Identification and quantification of Fc fusion peptibody degradations by limited proteolysis method. Analytical Biochemistry. 2012;428(2):137–142. DOI: 10.1016/j.ab.2012.06.002.

23. Giansanti P., Tsiatsiani L., Low T. Y., Heck A. J. R. Six alternative proteases for mass spectrometry-based proteomics beyond trypsin. Nature Protocols. 2016;11(5):993–1006. DOI: 10.1038/nprot.2016.057.

24. Carr S. A., Huddleston M. J., Bean M. F. Selective identification and differentiation of N- and O-linked oligosaccharides in glycoproteins by liquid chromatography-mass spectrometry: Analysis of N- and O-linked glycopeptides by LC-MS. Protein Science. 1993;2(2):183–196. DOI: 10.1002/pro.5560020207.

25. Huddleston M. J., Bean M. F., Carr S. A. Collisional fragmentation of glycopeptides by electrospray ionization LC/MS and LC/MS/MS: methods for selective detection of glycopeptides in protein digests. Analytical Chemistry. 1993;65(7):877–884. DOI: 10.1021/ac00055a009.

26. Huang L.-J., Lin J.-H., Tsai J.-H., Chu Y.-Y., Chen Y.-W., Chen S.-L., Chen S.-H. Identification of protein O-glycosylation site and corresponding glycans using liquid chromatography-tandem mass spectrometry via mapping accurate mass and retention time shift. Journal of Chromatography A. 2014;1371:136–145. DOI: 10.1016/j.chroma.2014.10.046.

27. Srikanth J., Agalyadevi R., Babu P. Targeted, Site-specific quantitation of N- and O-glycopeptides using 18O-labeling and product ion based mass spectrometry. Glycoconjugate Journal. 2017;34(1):95–105. DOI: 10.1007/s10719-016-9733-8.

28. Wang B., Tsybovsky Y., Palczewski K., Chance M. R. Reliable determination of site-specific in vivo protein N-glycosylation based on collision-induced MS/MS and chromatographic retention time. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2014;25(5):729–741. DOI: 10.1007/s13361-013-0823-6.

29. Kozlik P., Goldman R., Sanda M. Study of structure-dependent chromatographic behavior of glycopeptides using reversed phase nano-LC. Electrophoresis. 2017;38(17):2193–2199. DOI: 10.1002/elps.201600547.