Совместное определение основного метаболита молнупиравира (β-D-N4-гидроксицитидина) и фавипиравира в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС

Введение. Новая коронавирусная инфекция [Coronavirus Disease 2019 (COVID-19)] – острое инфекционное заболевание, вызываемое вирусом SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2), которое продолжает представлять серьезную опасность для здоровья. Молнупиравир и фавипиравир – противовирусные препараты с анти-РНК-полимеразной активностью, одобренные Министерством здравоохранения Российской Федерации для лечения COVID-19. Разработка и валидация методики совместного определения метаболита молнупиравира β-D-N4-гидроксицитидина и фавипиравира в плазме крови человека является необходимой процедурой для проведения аналитической части клинического исследования с целью дальнейшего изучения фармакокинетики.

Цель. Целью исследования является разработка и валидация методики совместного определения β-D-N4-гидроксицитидина и фавипиравира в плазме крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-селективным детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) для дальнейшего изучения фармакокинетики молнупиравира и фавипиравира.

Материалы и методы. Определение β-D-N4-гидроксицитидина и фавипиравира в плазме крови человека проводили методом ВЭЖХ-МС/МС. В качестве пробоподготовки был использован способ осаждения белков 0,1 % раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле. Внутренний стандарт: прометазин. Подвижная фаза: аммонийно-формиатный буфер 0,01 моль/л (Элюент А), 0,1 % муравьиной кислоты, 10 % воды в ацетонитриле с прибавлением 0,08 % аммиака (Элюент В). Колонка: Shim-pack GWS C18, 150 × 4,6 мм, 5 мкм. Аналитический диапазон методики: 50,00–10000,00 нг/мл для β-D-N4-гидроксицитидина, 250,00–20000,00 нг/мл для фавипиравира в плазме крови. Источник ионизации: электроспрей. Условия детектирования: 260,00 m/z → 82,10 m/z, 260,00 m/z → 111,00 m/z, 260,00 m/z → 127,95 m/z (β-D-N4-гидроксицитидин); 156,15 m/z → 65,95 m/z, 156,15 m/z → 85,00 m/z, 156,15 m/z → 113,10 m/z (фавипиравир); 285,05 m/z → 198,05 m/z (прометазин).

Результаты и обсуждение. Разработанная методика была валидирована по следующим параметрам: селективность, пригодность стандартного образца, эффект матрицы, калибровочная кривая, точность, прецизионность, степень извлечения, нижний предел количественного определения перенос пробы, стабильность.

Заключение. Разработана и валидирована методика совместного определения β-D-N4-гидроксицитидина и фавипиравира в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС. Подтвержденный аналитический диапазон методики составил 50,00–10000,00 нг/мл для β-D-N4-гидроксицитидина и 250,00–20000,00 нг/мл для фавипиравира в плазме крови. Полученный аналитический диапазон позволяет применять разработанную методику для проведения фармакокинетических исследований комбинированных препаратов молнупиравира и фавипиравира.

1. Li C. X., Noreen S., Zhang L. X., Saeed M., Wu P. F., Ijaz M., Dai D. F., Maqbool I., Madni A., Akram F., Naveed M. A critical analysis of SARS-CoV-2 (COVID-19) complexities, emerging variants, and therapeutic interventions and vaccination strategies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2022;146:112550. DOI: 10.1016/j.biopha.2021.112550.

2. Popovic M. XBB.1.5 Kraken Cracked: Gibbs Energies of Binding and Biosynthesis of the XBB.1.5 Variant of SARS-Cov-2. Preprints. 2023;2023010404. DOI: 10.20944/preprints202301.0404.v1.

3. Parums D. V. The XBB. 1.5 (‘Kraken’) Subvariant of Omicron SARS-CoV-2 and its Rapid Global Spread. Medical Science Monitor: International Medical. Journal of Experimental and Clinical Research. 2023;29:e939580. DOI: 10.12659/MSM.939580.

4. Lee C. C., Hsieh C. C., Ko W. C. Molnupiravir — A Novel Oral Anti-SARS-CoV-2 Agent. Antibiotics. 2021;10:1294. DOI: 10.3390/antibiotics10111294.

5. Pourkarim F., Pourtaghi-Anvarian S., Rezaee H. Molnupiravir: A new candidate for COVID-19 treatment. Pharmacology research & perspectives. 2022;10(1):e00909. DOI: 10.1002/prp2.909.

6. Gordon C. J., Tchesnokov E. P., Schinazi R. F., Götte M. Molnupiravir promotes SARS-CoV-2 mutagenesis via the RNA template. Journal of Biological Chemistry. 2021;297(1):100770. DOI: 10.1016/j.jbc.2021.100770.

7. Sharaf Y. A., El Deeb S., Ibrahim A. E., Al-Harrasi A., Sayed R. A. Two green micellar HPLC and mathematically assisted UV spectroscopic methods for the simultaneous determination of molnupiravir and favipiravir as a novel combined COVID-19 antiviral regimen. Molecules. 2022;27(7):2330. DOI: 10.3390/molecules27072330.

8. Балакин К. В., Стороженко Р. В., Якубова Е. В. Фавипиравир как средство терапии COVID-19. Научный бюллетень ХимРар. 2023;1.

9. Eloy P., Le Grand R., Malvy D., Guedj J. Combined treatment of molnupiravir and favipiravir against SARS-CoV-2 infection: One+ zero equals two? EBioMedicine. 2021;74:103663. DOI: 10.1016/j.ebiom.2021.103663.

10. Gouda A. S., Marzouk H. M., Rezk M. R., Salem A. M., Morsi M. I., Nouman E. G., Abdallah Y. M., Hassan A. Y., Abdel-Megied A. M. A validated LC-MS/MS method for determination of antiviral prodrug molnupiravir in human plasma and its application for a pharmacokinetic modeling study in healthy Egyptian volunteers. Journal of Chromatography B. 2022;1206:123363. DOI: 10.1016/j.jchromb.2022.123363.

11. Amara A., Penchala S. D., Else L., Hale C., FitzGerald R., Walker L., Lyons R., Fletcher T., Khoo S. The development and validation of a novel LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of Molnupiravir and its metabolite ß-d-N4-hydroxycytidine in human plasma and saliva. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. 2021;206:114356. DOI: 10.1016/j.jpba.2021.114356.

12. Parsons T. L., Kryszak L. A., Marzinke M. A. Development and validation of assays for the quantification of β-D-N4-hydroxycytidine in human plasma and β-D-N4-hydroxycytidine-triphosphate in peripheral blood mononuclear cell lysates. Journal of Chromatography B. 2021;1182:122921. DOI: 10.1016/j.jchromb.2021.122921.

13. Hailat M., Al-Ani I., Hamad M., Zakareia Z., Abu Dayyih W. Development and Validation of a Method for Quantification of Favipiravir as COVID-19 Management in Spiked Human Plasma. Molecules. 2021;26(13):3789. DOI: 10.3390/molecules26133789.

14. Abdallah I. A., Hammad S. F., Bedair A., Mansour F. R. Menthol-assisted homogenous liquid-liquid microextraction for HPLC/UV determination of favipiravir as an antiviral for COVID-19 in human plasma. Journal of Chromatography B. 2022;1189:123087. DOI: 10.1016/j.jchromb.2021.123087.

15. Комаров Т. Н., Карнакова П. К., Арчакова О. А., Щелгачева Д. С., Багаева Н. С., Шохин И. Е., Заславская К. Я., Белый П. А. Разработка и валидация методики определения фавипиравира в плазме крови человека методом ВЭЖХ-УФ. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(3):220–229. DOI: 10.33380/2305-2066-2022-11-3-220-229.

16. Megahed S., Habib A., Hammad S., Kamal A. Chemometric Approach Based on Factorial and Box-Behnken Designs for Determination of Anti Coronavirus Drug; Favipiravir in Bulk and Spiked Human Plasma by Green HPLC Method. Turkish Journal of Analytical Chemistry. 2021;3(2):70–78. DOI: 10.51435/turkjac.963652.

17. Morsy M. I., Nouman E. G., Abdallah Y. M., Zainelabdeen M. A., Darwish M. M., Hassan A. Y., Gouda A. S., Rezk M. R., Abdel-Megied A. M., Marzouk H. M. A Novel LC-MS/MS Method for Determination of the Potential Antiviral Candidate Favipiravir for the Emergency Treatment of SARS-CoV-2 Virus in Human Plasma: Application to a Bioequivalence Study in Egyptian Human Volunteers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2021;199:114057. DOI: 10.1016/j.jpba.2021.114057.

18. Rezk M. R., Badr K. A., Abdel-Naby N. S., Ayyad M. M. A Novel, Rapid and Simple UPLC–MS/MS Method for Quantification of Favipiravir in Human Plasma: Application to a Bioequivalence Study. Biomedical Chromatography. 2021;35(7):e5098. DOI: 10.1002/bmc.5098.