Методика тестирования лекарственных средств на принадлежность к субстратам и ингибиторам белка-транспортера BCRP на клетках линии Caco-2

Введение. Белок резистентности рака молочной железы (BCRP) является эффлюксным мембранным транспортером, контролирующим фармакокинетику большого числа лекарственных средств. Его активность может изменяться на фоне приема ряда эндо- и экзогенных веществ, таким образом, делая его звеном межлекарственных взаимодействий.

Цель. Цель исследования – разработка методики тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам и ингибиторам BCRP in vitro.

Материалы и методы. Работа выполнена на клетках Сасо-2 гиперэкспрессирующих BCRP; культивирование проводили в трансвелл-системе, состоящей из апикальной и базолатеральной камер. На дно апикальной камеры (полупроницаемая мембрана) высеивали клетки. Оценивался транспорт субстратов BCRP: метотрексата, митоксантрона и кверцетина в концентрациях 1–50 мкМ в направлении из базолатеральной камеры в апикальную (Papp b-a) и в обратном направлении (Papp a-b). Отношение Papp b-a / Papp a-b более «2» характеризует участие транспортера в переносе веществ. Для подтверждения участия BCRP в транспорте тест-субстратов эксперимент проводился с добавлением в камеры ингибитора транспортера – резерпина (50 мкМ). Концентрацию субстратов определяли методом ВЭЖХ-МС/МС.

Результаты и их обсуждение. При добавлении метотрексата (1 мкМ), митоксантрона (1 мкМ) и кверцетина (1−10 мкМ) в обе камеры их содержание в камере-реципиенте не детектировалось. При концентрации метотрексата 5 мкМ отношение Papp b-a / Papp a-b составило 3,38 ± 0,08, что свидетельствует об участии транспортера в его переносе. При концентрации вещества (10 и 50 мкМ) Papp b-a / Papp a-b снижалось до значений ниже «2». При концентрации митоксантрона 5 мкМ Papp b-a / Papp a-b составило 2,72 ± 0,16. Увеличение концентрации до 10 мкМ привело к росту Papp b-a / Papp a-b до 6,18 ± 0,08. При содержании вещества 50 мкМ показатель снижался, но оставался выше значения 2. В концентрации кверцетина 50 мкМ Papp b-a / Papp было ниже «2». Резерпин снижал Papp b-a / Papp a-b метотрексата в 3,31 раза (p = 0,0002), что свидетельствует об устранении асимметрии транспорта вещества. При концентрации митоксантрона 10 мкМ резерпин снижал его Papp b-a / Papp a-b в 3,36 раза (p < 0,0001). Результаты свидетельствуют об участии BCRP в контроле переноса обоих веществ через клеточный монослой.

Заключение. Разработана и апробирована на клетках линии Caco-2 методика тестирования лекарственных средств на принадлежность к субстратам и ингибиторам BCRP с использованием в качестве маркерных субстратов метотрексата (5 мкМ) и митоксантрона (10 мкМ), а в качестве ингибитора – резерпина (50 мкМ).

1. Sarkadi B., Homolya L., Hegedus T. The ABCG2/BCRP transporter and its variants – from structure to pathology. FEBS Lett. 2020;594(23):4012–4034. DOI: 10.1002/1873-3468.13947.

2. Doyle L. A., Yang W., Abruzzo L. V., Krogmann T., Gao Y., Rishi A. K., Ross D. D. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1998;95(26):15665–15670. DOI: 10.1073/pnas.95.26.15665.

3. Maliepaard M., Scheffer G. L., Faneyte I. F., van Gastelen M. A., Pijnenborg A. C., Schinkel A. H., van De Vijver M. J., Scheper R. J., Schellens J. H. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Research. 2001;61(8):3458–3464.

4. Jonker J. W., Smit J. W., Brinkhuis R. F., Maliepaard M., Beijnen J. H., Schellens J. H., Schinkel A. H. Role of breast cancer resistance protein in the bioavailability and fetal penetration of topotecan. Journal of the National Cancer Institute. 2000;92(20):1651–1656. DOI: 10.1093/jnci/92.20.1651.

5. Mao Q., Unadkat J. D. Role of the breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in drug transport--an update. The AAPS Journal. 2015;17(1):65–82. DOI: 10.1208/s12248-014-9668-6.

6. Bircsak K. M., Gibson C. J., Robey R. W., Aleksunes L. M. Assessment of drug transporter function using fluorescent cell imaging. Current Protocols in Toxicology. 2013;57(1). DOI: 10.1002/0471140856.tx2306s57.

7. Zhang Y., Gupta A., Wang H., Zhou L., Vethanayagam R. R., Unadkat J. D., Mao Q. BCRP transports dipyridamole and is inhibited by calcium channel blockers. Pharmaceutical Research. 2005;22(12):2023–2034. DOI: 10.1007/s11095-005-8384-4.

8. Yasuda K., Ganguly S., Schuetz E. G., Pheophorbide A. Fluorescent Bcrp Substrate to Measure Oral Drug-Drug Interactions in Real-Time In Vivo. Drug Metabolism and Disposition. 2018;46(11):1725–1733. DOI: 10.1124/dmd.118.083584.

9. Mukkavilli R., Jadhav G., Vangala S. Evaluation of Drug Transport in MDCKII-Wild Type, MDCKII-MDR1, MDCKII-BCRP and Caco-2 Cell Lines. Current Pharmaceutical Biotechnology. 2017;18(14):1151–1158. DOI: 10.2174/1389201019666180308091855.

10. Sesink A. L., Arts I. C., de Boer V. C., Breedveld P., Schellens J. H., Hollman P. C., Russel F. G. Breast cancer resistance protein (Bcrp1/Abcg2) limits net intestinal uptake of quercetin in rats by facilitating apical efflux of glucuronides. Molecular Pharmacology. 2005;67(6):1999–2006. DOI: 10.1124/mol.104.009753.

11. Якушева Е. Н., Щулькин А. В., Черных И. В., Попова Н. М., Котлярова А. А., Слепнев А. А. Метод анализа принадлежности лекарственных веществ к субстратам и ингибиторам белка-транспортера гликопротеина-P in vitro. Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2019;17(1):71–78. DOI: 10.17816/RCF17171-78.

12. Hilgers A. R., Conradi R. A., Burton P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 1990;7(9):902–910. DOI: 10.1023/a:1015937605100.

13. Elsby R., Surry D. D., Smith V. N., Gray A. J. Validation and application of Caco-2 assays for the in vitro evaluation of development candidate drugs as substrates or inhibitors of P-glycoprotein to support regulatory submissions. Xenobiotica. 2008;38(7–8):1140–1164. DOI: 10.1080/00498250802050880.

14. Щулькин А. В., Абаленихина Ю. В., Черных И. В., Ерохина П. Д., Якушева Е. Н. Роль P-гликопротеина в ограничении проницаемости клеточных мембран при окислительном стрессе. Биохимия. 2021;86(2):236–247. DOI: 10.31857/S0320972521020081.

15. Maksimovic V., Pavlovic-Popovic Z., Vukmirovic S., Cvejic J., Mooranian A., Al-Salami H., Mikov M., Golocorbin-Kon S. Molecular mechanism of action and pharmacokinetic properties of methotrexate. Molecular Biology Reports. 2020;47(6):4699–4708. DOI: 10.1007/s11033-020-05481-9.

16. Li H., Li J., Liu L., Zhang Y., Luo Y., Zhang X., Yang P., Zhang M., Yu W., Qu S. Elucidation of the Intestinal Absorption Mechanism of Celastrol Using the Caco-2 Cell Transwell Model. Planta Medica. 2016;82(13):1202–1207. DOI: 10.1055/s-0035-1568597.