Разработка и валидация методики количественного определения апиксабана в плазме крови с помощью метода ВЭЖХ-МС/МС

Введение. Апиксабан – антикоагулянт, применяющийся при ряде тромбоэмболических заболеваний и обладающий улучшенным соотношением пользы от приема препарата и рисков развития кровотечения согласно многочисленным клиническим исследованиям. В связи с назначением апиксабана в качестве антитромботической терапии пациентам с COVID-19 наблюдается рост его применения. Таким образом, из-за большого распространения апиксабана и необходимости проведения фармакокинетических исследований и исследований биоэквивалентности препаратов апиксабана важно разработать и валидировать простую и чувствительную методику количественного определения апиксабана в плазме крови.

Цель. Целью исследования является разработка и валидация методики определения апиксабана в плазме крови человека с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-селективным детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) для последующего проведения фармакокинетического исследования.

Материалы и методы. Определение апиксабана в плазме крови человека проводили с помощью ВЭЖХ-МС/МС, используя ривароксабан как внутренний стандарт. Пробоподготовка проводилась путем осаждения белков плазмы крови ацетонитрилом. Подвижная фаза: 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в воде (элюент А); 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (элюент В). Время анализа: 3,00 мин. Колонка: Shim-pack Velox Biphenyl; 2,7 мкм; 50 × 2,1 мм. Источник ионизации: электроспрей с положительным режимом ионизации. MRM-переходы: 460,15 → 443,10 m/z (апиксабан); 436,05 → 144,95 m/z (ривароксабан).

Результаты и обсуждение. Валидация проводилась согласно действующим требованиям ЕАЭС по следующим валидационным параметрам: селективность, калибровочная кривая, точность и прецизионность, нижний предел количественного определения, пригодность стандартных образцов, эффект матрицы, степень извлечения, стабильность, перенос пробы, отсутствие влияния разбавления образцов. Результаты оценки всех параметров соответствовали установленным критериям приемлемости.

Заключение. Подтвержденный аналитический диапазон разработанной и валидированной методики составил 1,00–300,00 нг/мл в плазме крови. Методика определения апиксабана в плазме крови является простой и чувствительной. Данная методика была апробирована во время аналитической части исследования биоэквивалентности и может применяться для других фармакокинетических исследований препаратов апиксабана.

1. Воробьева Н. М., Ткачева О. Н. Антикоагулянтная терапия у пожилых пациентов: дилемма выбора между эффективностью и безопасностью. Медицинский алфавит. 2018;2(16):6–14.

2. Панченко Е. П. Антитромботическая терапия ишемической болезни сердца: основы, проверенные временем. Терапевтический архив. 2019;91(6):19–24. DOI: 10.26442/00403660.2019.06.000296.

3. Бокарев И. Н., Кондратьева Т. Б. Новые оральные антикоагулянты в клинической практике. Эффективность и проблемы. Клиническая медицина. 2016;94(5):383–387. DOI: 10.18821/0023-2149-2016-94-5-383-387.

4. Van Rein N., Heide-Jørgensen U., Lijfering W. M., Dekkers O. M., Sørensen H. T., Cannegieter S. C. Major bleeding rates in atrial fibrillation patients on single, dual, or triple antithrombotic therapy: results from a Nationwide Danish Cohort Study. Circulation. 2019;139(6):775–786. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.036248.

5. Cools F., Wollaert B., Vervoort G., Verstraete S., Voet J., Hermans K., Heyse A., De Wolf A., Hollanders G., Boussy T., Anné W., Vercammen J., Faes D., Beutels M., Mairesse G., Purnode Ph., Blankoff I., Vandergoten P., Capiau L., Allu J., Bassand J., Kayani G. Treatment patterns in anticoagulant therapy in patients with newly diagnosed atrial fibrillation in Belgium: results from the GARFIELD-AF registry. Acta Cardiologica. 2018;74(4):309–318. DOI: 10.1080/00015385.2018.1494089.

6. Мелехов А. В., Гендлин Г. Е., Дадашова Э. Ф., Алексеева Е. М., Заиграев И. А., Никитин И. Г. Динамика применения антитромботических препаратов у больных с фибрилляцией предсердий: собственные данные и обзор отечественных регистров. Российский медицинский журнал.2017;23(3):116–126. DOI: 10.18821/0869-2106-2017-23-3-116-126.

7. Груздева А. А., Хохлов А. Л., Ильин М. В. Оральные антикоагулянты в профилактике тромоэмболических осложнений у кардиологических пациентов: анализ применения в Российской Федерации. Качественная клиническая практика. 2020;1:69–79. DOI: 10.37489/2588-0519-2020-1-69-79.

8. Колбин А. С., Касимова А. Р., Гиляревский С. Р. Сравнительный фармакоэкономический анализ применения апиксабана, ривароксабана и дабигатрана для профилактики развития инсульта и эмболий в сосуды большого круга кровообращения у пациентов с неклапанной фибрилляцией предсердий. Качественная клиническая практика. 2022;4:50–59. DOI: 10.37489/2588-0519-2022-4-50-59.

9. Dzudovic J., Sakac M. C., Antunovic M., Repic A., Obradovic S., Djordjevic S., Dzudovic B. Development and validation of LC-MS/MS method for determination of plasma apixaban. Acta Chromatographica. 2022;34(3):332–337. DOI: 10.1556/1326.2021.00948.

10. Levi M., Thachil J., Iba T., Levy J. H. Coagulation abnormalities and thrombosis in patients with COVID-19. Lancet Haematol. 2020;7:e438–e440. DOI: 10.1016/S2352-3026(20)30145-9.

11. Wenzler E., Engineer M. H., Yaqoob M., Benken S. T. Safety and efficacy of apixaban for therapeutic anticoagulation in critically Ill ICU patients with severe COVID-19 respiratory disease. TH Open: Companion Journal to Thrombosis and Haemostasis. 2020;4(04):e376–e382. DOI: 10.1055/s-0040-1720962.

12. Billett H. H., Reyes-Gil M., Szymanski J., Ikemura K., Stahl L. R., Lo Y., Rahman S., Gonzalez-Lugo J. D., Kushnir M., Barouqa M., Golestaneh L., Bellin E. Anticoagulation in COVID-19: effect of enoxaparin, heparin, and apixaban on mortality. Thrombosis and haemostasis. 2020;120(12):1691–1699. DOI: 10.1055/s-0040-1720978.

13. Appiah D., Quinn N. J., Messing E. G., Veltri K. T. Safety and efficacy analysis of apixaban compared to heparins in hospitalized non-critically ill COVID-19 patients. Hospital Pharmacy. 2022;57(6):727–733. DOI: 10.1177/00185787221095764.

14. Pinto D. J., Orwat M. J., Koch S., Rossi K. A., Alexander R. S., Smallwood A., Wong P. C., Rendina A. R., Luettgen J. M., Knabb R. M., He K., Xin B., Wexler R. R., Lam P. Y. Discovery of 1-(4-methoxyphenyl)-7-oxo-6-(4-(2-oxopiperidin-1-yl)phenyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-pyrazolo[3,4-c]pyridine-3-carboxamide (Apixaban, BMS-562247), a highly potent, selective, efficacious, and orally bioavailable inhibitor of blood coagulation factor Xa. Journal of medicinal chemistry. 2007;50(22):5339–5356. DOI: 10.1021/jm070245n.

15. Luettgen J. M., Knabb R. M., He K., Pinto D. J., Rendina A. R. Apixaban inhibition of factor Xa: microscopic rate constants and inhibition mechanism in purified protein systems and in human plasma. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2011;26(4):514–526. DOI: 10.3109/14756366.2010.535793.

16. Byon W., Garonzik S., Boyd R. A., Frost C. E. Apixaban: a clinical pharmacokinetic and pharmacodynamic review. Clinical pharmacokinetics. 2019;58(10):1265–1279. DOI: 10.1007/s40262-019-00775-z.

17. Granger C. B, Alexander J. H, McMurray J. J. V, Lopes R. D., Hylek E. M., Hanna M., Al-Khalidi H. R., Ansell J., Atar D., Avezum A., Bahit M. C., Diaz R., Easton J. D., Ezekowitz J. A., Flaker G., Garcia D., Geraldes M., Gersh B. J., Golitsyn S., Goto S., Hermosillo A. G., Hohnloser S. H., Horowitz J., Mohan P., Jansky P., Lewis B. S., Lopez-Sendon J. L., Pais P., Parkhomenko A., Verheugt F. W. A., Zhu J., Wallentin L. Apixaban versus Warfarin in Patients with Atrial Fibrillation. New England Journal of Medicine. 2011;365(11):981–992. DOI: 10.1056/NEJMoa1107039.

18. Романова М. В., Пузенко Д. В. Некоторые аспекты применения антикоагулянтов при венозных тромбоэмболиях, тромбоэмболии легочной артерии. Фокус на пожилых пациентов. Российский кардиологический журнал. 2022;27(3):97–106. DOI: 10.15829/1560-4071-2022-4944.

19. Hylek E. M., Held C., Alexander J. H., Lopes R. D., De Caterina R., Wojdyla D. M., Huber K., Jansky P., Steg Ph. G., Hanna M., Thomas L., Wallentin L., Granger C. B. Major bleeding in patients with atrial fibrillation receiving apixaban or warfarin: The ARISTOTLE Trial (Apixaban for Reduction in Stroke and Other Thromboembolic Events in Atrial Fibrillation): Predictors, Characteristics, and Clinical Outcomes. Journal of the American College of Cardiology. 2014;63(20):2141–2147. DOI: 10.1016/j.jacc.2014.02.549.

20. Avezum A., Lopes R. D., Schulte P. J., Lanas F., Gersh B. J., Hanna M., Pais P., Erol C., Diaz R., Bahit M. C., Bartunek J., De Caterina R., Goto S., Ruzyllo W., Zhu J., Granger C. B., Alexander J. H. Apixaban in comparison with warfarin in patients with atrial fibrillation and valvular heart disease: findings from the Apixaban for Reduction in Stroke and Other Thromboembolic Events in Atrial Fibrillation (ARISTOTLE) Trial. Circulation. 2015;132(8):624–632. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.114.014807.

21. Lip G. Y., Keshishian A., Li X., Hamilton M., Masseria C., Gupta K., Luo X., Mardekian J., Friend K., Nadkarni A., Pan X., Baser O., Deitelzweig S. Effectiveness and safety of oral anticoagulants among nonvalvular atrial fibrillation patients: the ARISTOPHANES study. Stroke. 2018;49(12):2933–2944. DOI: 10.1161/STROKEAHA.118.020232.

22. Fralick M., Colacci M., Schneeweiss S., Huybrechts K. F., Lin K. J., Gagne J. J. Effectiveness and safety of apixaban compared with rivaroxaban for patients with atrial fibrillation in routine practice: a cohort study. Annals of internal medicine. 2020;172(7):463–473. DOI: 10.7326/M19-2522.

23. Rutherford O. C. W., Jonasson C., Ghanima W., Söderdahl F., Halvorsen S. Comparison of dabigatran, rivaroxaban, and apixaban for effectiveness and safety in atrial fibrillation: a nationwide cohort study. European Heart Journal-Cardiovascular Pharmacotherapy. 2020;6(2):75–85. DOI: 10.1093/ehjcvp/pvz086.

24. Jeong H.-C., Kim T.-E., Shin K.-H. Quantification of apixaban in human plasma using ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Translational and Clinical Pharmacology. 2019;27(1):33–41. DOI: 10.12793/tcp.2019.27.1.33.

25. Rodina T. A., Melnikov E. S., Aksenov A. A., Belkov S. A., Sokolov A. V., Prokof’ev A. B., Ramenskaya G. V. Simultaneous Determination of Dabigatran, Rivaroxaban, Apixaban, and Warfarin in Human Blood Serum by HPLC-MS/MS for Therapeutic Drug Monitoring. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2022;56(2):289–293. DOI: 10.1007/s11094-022-02633-y.

26. Gouveia F., Bicker J., Santos J., Rocha M., Alves G., Falcão A., Fortuna A. Development, validation and application of a new HPLC-DAD method for simultaneous quantification of apixaban, dabigatran, edoxaban and rivaroxaban in human plasma. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2020;181:113109. DOI: 10.1016/j.jpba.2020.113109.

27. Cini M., Legnani C., Padrini R., Cosmi B., Dellanoce C., De Rosa G., Palareti G., Marcucci R., Pengo V., Poli D., Testa S. DOAC plasma levels measured by chromogenic anti-Xa assays and HPLC-UV in apixaban-and rivaroxaban-treated patients from the START-Register. International Journal of Laboratory Hematology. 2020;42(2):214–222. DOI: 10.1111/ijlh.13159.

28. Lindahl S., Dyrkorn R., Spigset O., Hegstad S. Quantification of apixaban, dabigatran, edoxaban, and rivaroxaban in human serum by UHPLC-MS/MS – method development, validation, and application. Therapeutic drug monitoring. 2018;40(3):369. DOI: 10.1097/FTD.0000000000000509.

29. Raghavan N., Frost C. E., Yu Z., He K., Zhang H., Humphreys W. G., Zhang D., Pinto D., Chen S., Bonacorsi S., Wong P. C. Apixaban metabolism and pharmacokinetics after oral administration to humans. Drug metabolism and disposition. 2009;37(1):74–81. DOI: 10.1124/dmd.108.023143.