Оптимизация метода рефолдинга Fc-слитого белка, полученного в бактериальной системе экспрессии

Введение. Производство Fc-слитых белков в прокариотических системах приводит к образованию нерастворимых агрегатов из-за неправильного сворачивания полипептидных цепей. Для получения функциональных белков требуется стадия рефолдинга, процесс подбора условий которого может быть трудоемким. Оптимизация параметров ренатурации с помощью подхода дизайна эксперимента (Design of Experiments, DoE) позволяет рассчитать оптимальные параметры процесса и оценить влияние факторов и их взаимодействий.

Цель. Оценка влияния концентраций окислителя, восстановителя и pH буфера ренатурации на эффективность рефолдинга Fc-слитого белка in vitro и определение оптимальных условий.

Материалы и методы. В работе использовали тельца включения Fc-слитого белка, полученные в бактериальной системе экспрессии Escherichia coli BL21. Планирование эксперимента осуществляли с помощью ортогонального композиционного дизайна (Orthogonal Central Composite design, CCO). Дизайн эксперимента, статистическую обработку данных и оптимизацию параметров производили в программе MODDE (v. 12.1, Sartorius Stedim Data Analytics AB, Германия). В качестве откликов использовали показатели хроматографической чистоты и выход целевого белка по данным высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографии.

Результаты и обсуждение. Проведена оптимизация условий ренатурации Fc-слитого белка с применением подхода DoE. На основании полученных данных были построены графики поверхности откликов и определены оптимальные значения параметров pH буферной среды, концентрации окислителя и восстановителя. Полученные статистические модели демонстрируют высокую прогностическую способность и воспроизводимость данных. Была проведена успешная валидация процесса рефолдинга в оптимизированных условиях. Наблюдали снижение количества высокомолекулярных примесей и неправильно свернутых форм белка в целевом продукте. Значение хроматографической чистоты целевого белка по данным высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографии удалось повысить более чем на 10 %.

Заключение. Было установлено значительное влияние pH буферного раствора, соотношения концентраций окислительно-восстановительной пары и их взаимное влияние на выход и хроматографическую чистоту Fc-слитого белка. Показана тесная взаимосвязь эффектов окислительного и восстановительного компонентов с pH раствора. Повышенный pH буферной среды улучшает растворимость белка, что создает лучшие условия для правильного сворачивания полипептидной цепи.

1. Jafari R., Zolbanin N. M., Rafatpanah H., Majidi J., Kazemi T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 2017;24(12):1228–1237. DOI: 10.2174/0929867324666170113112759.

2. Rath T., Baker K., Dumont J. A., Peters R. T., Jiang H., Qiao S.-W., Lencer W. I., Pierce G. F., Blumberg R. S. Fc-fusion proteins and FcRn: structural insights for longer-lasting and more effective therapeutics. Critical Reviews in Biotechnology. 2015;35(2):235–254. DOI: 10.3109/07388551.2013.834293.

3. Liu L. Pharmacokinetics of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins. Protein & Cell. 2018;9(1):15–32. DOI: 10.1007/s13238-017-0408-4.

4. Carrió M. M., Cubarsi R., Villaverde A. Fine architecture of bacterial inclusion bodies. FEBS Letters. 2000;471(1):7–11. DOI: 10.1016/S0014-5793(00)01357-0.

5. Bhatwa A., Wang W., Hassan Y. I., Abraham N., Li X.-Z., Zhou T. Challenges Associated With the Formation of Recombinant Protein Inclusion Bodies in Escherichia coli and Strategies to Address Them for Industrial Applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2021;9:630551. DOI: 10.3389/fbioe.2021.630551.

6. Maas C., Hermeling S., Bouma B., Jiskoot W., Gebbink M. F. B. G. A Role for Protein Misfolding in Immunogenicity of Biopharmaceuticals. Journal of Biological Chemistry. 2007;282(4):2229–2236. DOI: 10.1074/jbc.M605984200.

7. Micheletti C. Comparing proteins by their internal dynamics: Exploring structure–function relationships beyond static structural alignments. Physics of Life Reviews. 2013;10(1):1–26. DOI: 10.1016/j.plrev.2012.10.009.

8. Bahar I., Lezon T. R., Yang L.-W., Eyal E. Global Dynamics of Proteins: Bridging Between Structure and Function. Annual Review of Biophysics. 2010;39:23–42. DOI: 10.1146/annurev.biophys.093008.131258.

9. Seckler R., Jaenicke R. Protein folding and protein refolding. The FASEB Journal. 1992;6(8):2545–2552. DOI: 10.1096/fasebj.6.8.1592207;

10. Depuydt M., Messens J., Collet J.-F. How Proteins Form Disulfide Bonds. Antioxidants & Redox Signaling. 2011;15(1):49–66. DOI: 10.1089/ars.2010.3575.

11. Buscajoni L., Martinetz M. C., Berkemeyer M., Brocard C. Refolding in the modern biopharmaceutical industry. Biotechnology Advances. 2022;61:108050. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2022.108050.

12. Roufarshbaf M., Akbari V. Development of Solubilization and Refolding Buffers. In: Kopp J., Spadiut O., editors. Inclusion Bodies. Totowa: Humana Press; 2023. P. 155–164. DOI: 10.1007/978-1-0716-2930-7_10.

13. Feige M. J., Hendershot L. M. Disulfide bonds in ER protein folding and homeostasis. Current Opinion in Cell Biology. 2011;23(2):167–175. DOI: 10.1016/j.ceb.2010.10.012.

14. Narayan M. Revisiting the Formation of a Native Disulfide Bond: Consequences for Protein Regeneration and Beyond. Molecules. 2020;25(22):5337. DOI: 10.3390/molecules25225337.

15. Mandenius C.-F., Brundin A. Bioprocess optimization using design-of-experiments methodology. Biotechnology Progress. 2008;24(6):1191–1203. DOI: 10.1002/btpr.67.

16. De Bernardez Clark E. Protein refolding for industrial processes. Current Opinion in Biotechnology. 2001;12(2):202–207. DOI: 10.1016/S0958-1669(00)00200-7.

17. Maiti M., Rao M., Sastry S. Competition between folding and aggregation in a model for protein solutions. The European Physical Journal E. 2010;32(2):217–221. DOI: 10.1140/epje/i2010-10621-4.

18. Brusotti G., Calleri E., Colombo R., Massolini G., Rinaldi F., Temporini C. Advances on Size Exclusion Chromatography and Applications on the Analysis of Protein Biopharmaceuticals and Protein Aggregates: A Mini Review. Chromatographia. 2018;81(1):3–23. DOI: 10.1007/s10337-017-3380-5.

19. Alam P., Siddiqi K., Kumar Chturvedi S., Khan R. H. Protein aggregation: From background to inhibition strategies. International Journal of Biological Macromolecules. 2017;103:208–219. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2017.05.048.

20. Gervais D. Protein deamidation in biopharmaceutical manufacture: understanding, control and impact. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 2016;91(3):569–575. DOI: 10.1002/jctb.4850.

21. Góngora-Benítez M., Tulla-Puche J., Albericio F. Multifaceted Roles of Disulfide Bonds. Peptides as Therapeutics. Chemical Reviews. 2014;114(2):901–926. DOI: 10.1021/cr400031z.

22. Wang T., Fodor S., Hapuarachchi S., Grace Jiang X., Chen K., Apostol I., Huang G. Analysis and characterization of aggregation of a therapeutic Fc-fusion protein. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2013;72:59–64. DOI: 10.1016/j.jpba.2012.09.010.

23. Wiedemann C., Kumar A., Lang A., Ohlenschläger O. Cysteines and Disulfide Bonds as Structure-Forming Units: Insights From Different Domains of Life and the Potential for Characterization by NMR. Frontiers in Chemistry. 2020;8:280. DOI: 10.3389/fchem.2020.00280.

24. Yamaguchi H., Miyazaki M. Refolding Techniques for Recovering Biologically Active Recombinant Proteins from Inclusion Bodies. Biomolecules. 2014;4(1):235–251. DOI: 10.3390/biom4010235.

25. Walczak M. M., Dryer D. A., Jacobson D. D., Foss M. G., Flynn N. T. pH Dependent Redox Couple: An Illustration of the Nernst Equation. Journal of Chemical Education. 1997;74(10):1195.