Разработка методик контроля качества химического предшественника – рекомбинантного белка с анкириновыми повторами для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2 в злокачественных опухолях

Введение. Сверхэкспрессия рецептора HER2 ассоциирована с агрессивным течением онкологических заболеваний и неблагоприятным прогнозом. Традиционная иммуногистохимическая диагностика имеет ряд ограничений, включая инвазивность, невозможность оценки гетерогенности опухоли и тотального распространения процесса. Перспективной альтернативой является радионуклидная визуализация с использованием каркасных таргетных белков DARPin G3. По результатам доклинических исследований препарат ^99mTс[Tc]-G3-(G₃S)₃C был предложен для проведения I фазы клинических исследований. Экспериментальный препарат представляет собой стерильный лиофилизат химического предшественника в одном флаконе и должен соответствовать требованиям ОФС 1.11.0005 «Химические предшественники для радиофармацевтических лекарственных препаратов» и ОФС 1.7.1.0007.15 «Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК» Государственной фармакопеи РФ XV издания.

Цель. Целью настоящего исследования была разработка подходов и методик контроля качества белка DARPin G3-(G₃S)₃C, входящего в состав разработанной композиции лиофилизата химических предшественников для получения ^99mTс-содержащего препарата для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2 в злокачественных опухолях

Материалы и методы. Объектом исследования явился лиофилизат, содержащий DARPin G3-(G₃S)₃C со вспомогательными веществами. Для регистрации масс-спектров белка использовали ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометром, снабженным источником ионизации электрораспылением. Вертикальный электрофорез с натрия додецилсульфатом (SDS) в полиакриламидном геле с концентрацией акриламида 15 % проводили при напряжении 110 В в течение 2 ч. В качестве красящего раствора использовали раствор кумасси В-250. Тандемную масс-спектрометрию проводили с помощью системы ВЭЖХ с масс-спектрометром посредством наноэлектроспрейного источника. При корреляции аминокислотной последовательности карбамидометилирование Cys, деамидирование Asn/Gln и окисление Met учитывались как вариабельные модификации. Для определения количества белка в лиофилизате был использован спектрофотометрический метод при длине волны 280 нм. Валидационная оценка разработанной методики проводилась в соответствии с требованиями ОФС.1.1.0012 «Валидация аналитических методик» Государственной фармакопеи РФ XV издания.

Результаты и обсуждение. Подлинность и чистота DARPin G3-(G₃S)₃C была подтверждена с использованием ВЭЖХ-МС. Молекулярная масса мономера согласуется с расчетной и составила 14075,9 Да с точностью до 0,5 Да, чистота белка была близка к 100 %. Для определения подлинности и чистоты DARPin G3-(G₃S)₃C методом электрофореза в полиакриаламидном геле предложено использовать 2 мкг и 20 мкг белка соответственно. Рассчитанная молекулярная масса белка составила 13,58 ± 0,82 кДа. В лиофилизате содержание примеси гомодимера, определенной электрофорезом в полиакриламидном геле, не превышало 3 %, другие белковые примеси наблюдались в количестве не более 1 %. Чистота белка, установленная методом ВЭЖХ-МС/МС для анализа первичной структуры, составила 98 %. Перекрытие аминокислотной последовательности целевого белка с идентифицированными пептидными фрагментами составило 100 %. В результате анализа гидролизата белка было идентифицировано более 700 его пептидных фрагментов (значение –10LоgP – более 20). Разработанная методика УФ-спектрофотомерии соответствует валидационным требованиям и позволяет определять количественного содержание белка DARPin G3-(G₃S)₃C в лиофилизате ±10 % от номинального содержания.

Заключение. Для определения показателя «подлинность» нового химического предшественника белка DARPin G3-(G₃S)₃C в составе лиофилизата для получения  ^99mTс-содержащего препарата для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2 в злокачественных опухолях были предложены методики масс-спектрометрии, пептидного картирования, электрофорез в полиакриламидном геле. Для показателя «родственные примеси» – методика электрофореза в полиакриламидном геле. Для определения показателя «количественное определение» – методика УФ-спектрофотометрии.

1. Bartley A. N., Washington M. K., Ventura C. B., Ismaila N., Colasacco C., Benson A. B., Carrato A., Gulley M. L., Jain D., Kakar S., Mackay H. J., Streutker C., Tang L., Troxell M., Ajani J. A. HER2 Testing and Clinical Decision Making in Gastroesophageal Adenocarcinoma: Guideline From the College of American Pathologists, American Society for Clinical Pathology, and American Society of Clinical Oncology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2016;140(12):1345–1363. DOI: 10.5858/arpa.2016-0331-CP.

2. Gebhart G., Lamberts L. E., Wimana Z., Garcia C, Emonts P., Ameye L., Stroobants S., Huizing M., Aftimos P., Tol J., Oyen W. J. G., Vugts D. J., Hoekstra O. S., Schröder C. P., Menke-van der Houven van Oordt C. W., Guiot T., Brouwers A. H., Awada A., de Vries E. G. E., Flamen P. Molecular imaging as a tool to investigate heterogeneity of advanced HER2-positive breast cancer and to predict patient outcome under trastuzumab emtansine (T-DM1): the ZEPHIR trial. Annals of oncology. 2016;27(4):619–624. DOI: 10.1093/annonc/mdv577.

3. Tolmachev V. Imaging of HER-2 overexpression in tumors for guiding therapy. Current Pharmaceutical Design. 2008;14(28):2999–3019. DOI: 10.2174/138161208786404290.

4. Wolff A. C., Somerfield M. R., Dowsett M., Hammond M. E. H., Hayes D. F., McShane L. M., Saphner T. J., Spears P. A., Allison K. H. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer: ASCO-College of American Pathologists Guideline Update. Journal of Clinical Oncology. 2023;41(22):3867–3872. DOI: 10.1200/jco.22.02864.

5. Azhar A., Ahmad E., Zia Q., Rauf M. A., Owais M., Ashraf G. M. Recent advances in the development of novel protein scaffolds based therapeutics. International Journal of Biological Macromolecules. 2017;102:630–641. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2017.04.045.

6. Sörensen J., Velikyan I., Sandberg D., Wennborg A., Feldwisch J., Tolmachev V., Orlova A., Sandström M., Lubberink M., Olofsson H. Measuring HER2-receptor expression in metastatic breast cancer using [68Ga] ABY-025 Affibody PET/CT. Theranostics. 2016;6(2):262.

7. Skuridin V. S., Stasyuk E. S., Bragina O. D., Yusubov M. S., Chernov V. I., Larkina M. S., Zelchan R. V., Rogov A., Sinilkin I., Larionova L. Development of radiopharmaceutical based on mini-antibody for early cancer detection. Annual Congress of the European-Association-of-Nuclear-Medicine. 2016;43:465–465.

8. Брагина О. Д., Ларькина М. С., Стасюк Е. С., Чернов В. И., Юсубов М. С., Скуридин В. С., Деев С. М., Зельчан Р. В., Булдаков М. А., Подрезова Е. В., Белоусов М. В. Разработка высокоспецифичного радиохимического соединения на основе меченых ^99mТс рекомбинантных адресных молекул для визуализации клеток с гиперэкспрессией Her-2/neu. Бюллетень сибирской медицины. 2017;16(3):25–33. DOI: 10.20538/1682-0363-2017-3-25-33.

9. Брагина О. Д., Чернов В. И., Зельчан Р. В., Синилкин И. Г., Медведева А. А., Ларькина М. С. Альтернативные каркасные белки в радионуклидной диагностике злокачественных образований. Бюллетень сибирской медицины. 2019;18(3):125–133. DOI: 10.20538/1682-0363-2019-3-125-133.

10. Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annual review of pharmacology and toxicology. 2015;55:489–511.

11. Deyev S. M., Xu T., Liu Y., Schulga A., Konovalova E., Garousi J., Rinne S. S., Larkina M., Ding H., Gräslund T., Orlova A., Tolmachev V., Vorobyeva A. Influence of the Position and Composition of Radiometals and Radioiodine Labels on Imaging of Epcam Expression in Prostate Cancer Model Using the DARPin Ec1. Cancers. 2021;13(14):3589. DOI: 10.3390/cancers13143589.

12. Zelchan R., Chernov V., Medvedeva A., Rybina A., Bragina O., Mishina E., Larkina M., Varvashenya R., Fominykh A., Schulga A., Konovalova E., Vorobyeva A., Orlova A., Tashireva L., Deyev S. M., Tolmachev V. Phase I Clinical Evaluation of Designed Ankyrin Repeat Protein [^99mTc]Tc(CO)₃-(HE)₃-Ec1 for Visualization of EpCAM-Expressing Lung Cancer. Cancers. 2024;16(16):2815. DOI: 10.3390/cancers16162815.

13. Kobe B, Kajava A.V. When protein folding is simplified to protein coiling: the continuum of solenoid protein structures. Trends in Biochemical Sciences. 2000;25(10):509–515. DOI: 10.1016/s0968-0004(00)01667-4.

14. Binz H. K., Stumpp M. T., Forrer P., Amstutz P., Plückthun A. Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins. Journal of Molecular Biology. 2003;332(2):489–503. DOI: 10.1016/s0022-2836(03)00896-9.

15. Goldstein R., Sosabowski J., Livanos M., Leyton J., Vigor K., Bhavsar G., Nagy-Davidescu G., Rashid M., Miranda E., Yeung J., Tolner B., Plückthun A., Mather S., Meyer T., Chester K. Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular imaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 2015;42(2):288–301. DOI: 10.1007/s00259-014-2940-2.

16. Vorobyeva A., Schulga A., Konovalova E., Güler R., Löfblom J., Sandström M., Garousi J., Chernov V., Bragina O., Orlova A. Optimal composition and position of histidine-containing tags improves biodistribution of 99mTc-labeled DARPin G3. Scientific Reports. 2019;9(1):9405.

17. Bragina O., Chernov V., Schulga A., Konovalova E., Garbukov E., Vorobyeva A., Orlova A., Tashireva L., Sörensen J., Zelchan R., Medvedeva A., Deyev S., Tolmachev V. Phase I Trial of ^99mТс-(HE)₃-G3, a DARPin-Based Probe for Imaging of HER2 Expression in Breast Cancer. Journal of Nuclear Medicine. 2022;63(4):528–535. DOI: 10.2967/jnumed.121.262542.

18. Larkina M., Plotnikov E., Bezverkhniaia E., Shabanova Y., Tretyakova M., Yuldasheva F., Zelchan R., Schulga A., Konovalova E., Vorobyeva A. Comparative Preclinical Evaluation of Peptide-Based Chelators for the Labeling of DARPin G3 with ^99mТс for Radionuclide Imaging of HER2 Expression in Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2022;23(21):13443.

19. Larkina M., Varvashenya R., Yuldasheva F., Plotnikov E., Bezverkhniaia E., Tretyakova M., Zelchan R., Schulga A., Konovalova E., Vorobyeva A., Belousov M., Orlova A., Tolmachev V., Deyev S. Comparative Preclinical Evaluation of HYNIC-Modified Designed Ankyrin Repeat Proteins G3 for the ^99mТс-Based Imaging of HER2-Expressing Malignant Tumors. Molecular Pharmaceutics. 2024;21(4):1919–1932. DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.3c01173.

20. Варвашеня Р. Н. Прач А. А., Плотников Е. B., Деев С. М., Белоусов М. В., Ларькина М. С., Чернов В. И. Оценка функциональной пригодности лиофилизата таргетных каркасных белков с анкириновыми повторами для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2/neu в злокачественных опухолях. Бюллетень сибирской медицины. 2024;23(3):16–24. DOI: 10.20538/1682-0363-2024-3-16-24.

21. Malakhov M. P., Mattern M. R., Malakhova O. A., Drinker M., Weeks S. D., Butt T. R. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural and Functional Genomics. 2004;5(1–2):75–86.

22. Vorobyeva A., Sсhulga A., Konovalova E., Güler R., Mitran B., Garousi J., Rinne S., Löfblom J., Orlova A., Deyev S. Comparison of tumor-targeting properties of directly and indirectly radioiodinated designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 variants for molecular imaging of HER2. International Journal of Oncology. 2019;54(4):1209–1220.

23. Киселева Д. Г., Зигашин Р. Х., Фотин Д. П.,Маркин А. М., Проатерогенный протеомный профиль ЛПНП, полученных от пациентов с сахарным диабетом: иммунологические аспекты. Российский иммунологический журнал. 2024;27(2):253–258. DOI: 10.46235//1028-7221-16674-PPP.

24. Ma B., Zhang K., Hendrie C., Liang C., Li M., Doherty-Kirby A., Lajoie G. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2003;17(20):2337–2342. DOI: 10.1002/rcm.1196.

25. Gill S. C., von Hippel P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 1989;182(2):319–326. DOI: 10.1016/0003-2697(89)90602-7.