Резюме. В статье рассмотрено применение двух мощных техник ЯМР ME-HSQC и HMBC для определения строения молекул на настольном ЯМР спектрометре X-Pulse на примере молекулы гемфиброзила. Полученные результаты дают основания утверждать, что применение настольного спектрометра X-Pulse позволяет получить надежные результаты за короткое время.

Метод ядерного магнитного резонанса широко применяется в синтетической химии для исследования строения молекул. Широкое применение он нашел и в фармацевтической индустрии, как метод исследования строения фармацевтических субстанций и определения примесей,  ОФС.1.2.1.1.0007.15 и ОФС.1.7.2.0014.15. В настоящее время в области ЯМР приборостроения активно  развивается направление настольных ЯМР спектрометров без криогенных магнитов [1-6]. Спектр решаемых задач настольными приборами постоянно расширяется с ростом их характеристик.

 Одним из значительных достижений в области ЯМР с момента его создания стало внедрение 2-мерных (2D) ЯМР-экспериментов. Их использование значительно повысило мощность метода ЯМР для подтверждения строения молекул, расширили круг и сложность решаемых проблем.

Данные эксперименты представляют собой серию одномерных (1D) экспериментов, отличающихся лишь шагом по времени, который вводится через последовательность импульсов. В результате получается двумерный массив данных с двумя отдельными временными изменениями – прямым измерением (t2) и непрямым (t1) измерением. В результате двумерного дискретного преобразования Фурье получается двумерный спектр с двумя осями F1 и F2, по которым отложено значение частоты. Эксперименты по двумерной гетереядерной корреляции широкой применяются в ЯМР, при работе на спектрометрах с сильным полем. Представляется важным, чтобы данная мощная практика нашла широкое применение среди настольных ЯМР спектрометров 60 МГц с постоянными магнитами, которые значительно дешевле и проще в обслуживании и эксплуатации. И которые с успехом применяются для решения широкого спектра задач по исследованию строения молекул.

Рисунок 1. Химическая структура гемфиброзила

Эксперименты с гетероядерными корреляциями позволяют определять взаимосвязь между сигналами протона и углерода через спин-спиновое взаимодействие и используются для определения строения неизвестного соединения. В данной статье рассмотрены результаты двух таких эксперимента, ME-HSQC [7] и HMBC [7]. Эти эксперименты часто описываются как обратные эксперименты, поскольку сигналы от протона измеряются напрямую, а сигнал от ядра X (например, ¹³C или любого другого X) через протонный канал прибора для максимизации чувствительности экспериментов. Это позволяет выполнять гетероядерные корреляции намного быстрее, чем в обычном эксперименте HETCOR [7], и сокращает необходимое время с нескольких часов до десятков минут. В статье иллюстрируются данные эксперименты на примере 1M раствора гемфиброзила (рисунок 1), лекарственного препарата, используемого для лечения аномальных уровней содержания липидов в крови.

Метод ME-HSQC позволяет установить прямую связь спектров полученных на протоне и на углероде. Сигнал от протона может коррелировать с сигналом от углерода, с которым он непосредственно химически связан.  В спектре HSQC данная корреляция проявляется как перекрестные пики (пики, появляющиеся как в протонном, так и в углеродном спектре). Сигналы в 1D спектре углерода  без перекрестного пика определяются быстро как сигналы от четвертичных атомов углерода.

Популярным дополнением к базовому эксперименту HSQC является эксперимент с, так называемой, корректировкой по мультиплетности (ME), иногда называемый откорректированным по DEPT [7], так как результат очень похож на результат эксперимента DEPT-135, только в двумерном варианте. Аналогично эксперименту HSQC, сигналы от протона и углерода, которые непосредственно химически связаны, сопряжены через перекрестный пик в спектре ME-HSQC. В дополнении, используемая импульсная последовательность, позволяет получить взаимосвязь между фазой сигнала и количеством связей атома углерода с протонами, т.е. тип углеродного атома (первичный, вторичный, третичный, четвертичный). Пики групп CH₃ и CH являются положительными (красные на рисунке 2), а пики групп CH₂ являются отрицательными (синие на рисунке 2). Способность быстро определять тип углеродного атома важна для исследования строения. Одномерный углеродный спектр на рисунке 2 дает информацию лишь по амплитуде сигнала, и не дает информацию о его фазе, поэтому пики групп CH₂ являются положительными. Полный двумерный спектр, полученный методом ME-HSQC для гемфиброзила показан на рисунке 2.

Рисунок 2. Спектр ME-HSQC для 1M раствора гемфиброзила. 4 сканирования с общим временем эксперимента 35 мин. Спектр получен на настольном ЯМР спектрометре X-Pulse. Числа на перекрестных пиках соответствуют пронумерованным позициям углеродных атомов на рисунке 1.

Эксперимент HSQC дает ценную информацию об углеводородных функциональных группах, чего обычно достаточно для подтверждения известной структуры. Однако, этого недостаточно для установления строения неизвестной молекулы. В целом, определение строения требует больше информации о связях вдоль углеродного скелета молекулы. Эксперимент HMBC позволяет получить эту информацию.

В эксперименте  HMBC сигналы от протонов коррелируются с сигналами от ядер углерода, расположенными на расстоянии 2, 3 иногда 4 связи друг от друга.  При рассмотрении части углеводородной цепочки типа: в спектре ME-HSQC проявятся перекрестные пики между  и,  и, и  и .  Перекрестный пик между  и  будет отрицательным (синим). В спектре HMBC перекрестные пики HSQC будут подавлены, и вместо этого будут наблюдаться перекрестные пики  с  и,  с  и  и  с  и . Комбинация двух спектров позволяет пользователю ЯМР определить углеводородный скелет молекулы и связанные с ним углеводородные группы. Полный спектр HMBC гемфиброзила показан на рисунке 3.

Рисунок 3. Спектр HMBC для 1M раствора гемфиброзила. 16 сканирований с общим временем эксперимента 1 час 40 минут. Спектр получен на настольном ЯМР спектрометре X-Pulse.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что настольный ЯМР спектрометр X-Pulse является надежным инструментом для проведения экспериментов по гетероядерной корреляции.  Эксперименты ME-HSQC, HMBC позволяют пользователям определять структуру совершенно неизвестных молекул путем получения корреляционных двумерных спектров на настольном приборе. Применение этих экспериментов позволяет получать более высокую чувствительность при измерении сигналов протонов и получать надежные данные по строению молекул неизвестных соединений менее чем за 3 часа.

Ссылки.

1. Pagès G., Gerdova A., Williamson D., Gilard V., Martino R., Malet-Martino M. ACS Analytical Chemistry. 86:11897-11904.
2. Калабин Г. А., Васильев В. Г., Ивлев В. А., Комаров Н. А., Абрамович Р. А. 
   Быстрый скрининг лекарственных средств без стандартных образцов: ренессанс низкопольных спектрометров ЯМР. Аналитика. 2017;6:44-50.
3. Gerdova A., Defemez M., Jakes W., Limer E., McCallum C., Nott K., Parker T., Rigby N., Sagidullin A., Watson A. D., Williamson D., Kemsley E. K. Chapter in "Magnetic Resonance in Food Science: Defending Food by Magnetic Resonance", Editors F Capozzi, L Laghi, PS Belton, Royal Society of Chemistry. 2015, 223 p.
4. Caprio V., McLachlan A. S., Sutcliffe O. B., Williamson D. C., Mewis R. E. 
   Structural Elucidation of Unknowns: A Spectroscopic Investigation with an Emphasis on 1D and 2D 1H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Chemistry: Bulgarian Journal of Science Education. 2018;27(2):223-234.
5. Fallaise D., Tweedie H. B., Konzuk J., Cheyne C., Mack E. E., Longstaffe J. G. Practical application of 1H benchtop NMR spectroscopy for the characterization of a nonaqueous phase liquid from a contaminated environment. Magnetic Resonance in Chemistry. 2019;57(2-3):93-100. DOI: 10.1002/mrc.4816.
6. Antonides L. H., Brignall R. M., Costello A., Ellison J., Firth S. E., Gilbert N., Groom B. J., Hudson S. J., Hulme M. C., Marron J., Pullen Z. A., Robertson T. B. R., Schofield C. J., Williamson D. C., Kemsley E. K., Sutcliffe O. B., Mewis R. E. 

   Rapid Identification of Novel Psychoactive and Other Controlled Substances Using Low-Field 1H NMR Spectroscopy. ACS Omega. 2019;4(4):7103-7112. DOI: 10.1021/acsomega.9b00302.

7. Claridge T. D.W. High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry. Volume 2. Amsterdam: Elsevier Science; 2008. 398 p.