Валидация тест-системы на основе метода иммуноферментного анализа для определения концентрации бевацизумаба в биологических жидкостях

Введение. Одной из причин развития множества заболеваний, в первую очередь злокачественных, является повышенная экспрессия фактора роста эндотелия сосудов (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF). Бевацизумаб является препаратом для нейтрализации биологической активности VEGF и представляет собой рекомбинантные гуманизированные антитела. Его применение снижает васкуляризацию в очагах повышенной экспресии VEGF, что замедляет опухолевый рост, а также способствует восстановлению зрения при ряде офтальмологических заболеваний. Для определения концентрации бевацизумаба в биологических жидкостях человека представлена тест-система на основе иммуноферментного анализа (ИФА).

Цель. Целью работы является валидация данной тест-системы.

Материалы и методы. Бланковые сыворотки добровольцев, раствор бевацизумаба, иммуноферментный анализ, твердофазный «сэндвич»-ИФА-набор, микропланшетный фотометр.

Результаты и обсуждение. Определены следующие характеристики тест-системы: нижний предел количественного определения – 2,0 мкг/мл, верхний калибровочный диапазон – до 200 мкг/мл, правильность и прецизионность внутри одной серии и между сериями не превышает 20 %, а общая ошибка метода – 30 %, краткосрочная стабильность для образцов при комнатной температуре – 6 часов, долгосрочная стабильность – 14 дней при –20 °С, возможность трехкратного замораживания/оттаивания образцов, возможность определения образцов с концентрацией выше верхнего калибратора после разбавления в 2 раза.

Заключение. Полученные результаты полностью соответствуют международным критериям приемлемости и позволяют использовать тест-систему ИФА производства ООО «НПЦ Пробиотек» для применения в области клинической лабораторной диагностики.

1. Apte R. S., Chen D. S., Ferrara N. VEGF in Signaling and Disease: Beyond Discovery and Development. Cell. 2019;176(6):1248–1264. DOI: 10.1016/j.cell.2019.01.021.

2. Vincent L., Jin D. K., Karajannis M. A., Shido K., Hooper A. T., Rashbaum W. K., Pytowski B., Wu Y., Hicklin D. J., Zhu Z., Bohlen P., Niesvizky R., Rafii S. Fetal stromal-dependent paracrine and intracrine vascular endothelial growth factor-A/vascular endothelial growth factor receptor-1 signaling promotes proliferation and motility of human primary myeloma cells. Cancer Research. 2005;65(8):3185–3192. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-04-3598.

3. Cao Y., Guangqi E., Wang E., Pal K., Dutta S. K., Bar-Sagi D., Mukhopadhyay D. VEGF exerts an angiogenesis-independent function in cancer cells to promote their malignant progression. Cancer Research. 2012;72(16):3912–3918. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-11-4058.

4. Lee T.-H., Seng S., Sekine M., Hinton C., Fu Y., Avraham H. K., Avraham S. Vascular endothelial growth factor mediates intracrine survival in human breast carcinoma cells through internally expressed VEGFR1/FLT1. PLoS Medicine. 2007;4(6):e186. DOI: 10.1371/journal.pmed.0040186.

5. Lichtenberger B. M., Tan P. K., Niederleithner H., Ferrara N., Petzelbauer P., Sibilia M. Autocrine VEGF signaling synergizes with EGFR in tumor cells to promote epithelial cancer development. Cell. 2010;140(2):268–279. DOI: 10.1016/j.cell.2009.12.046.

6. Bhattacharya R., Ye X.-C., Wang R., Ling X., McManus M., Fan F., Boulbes D., Ellis L. M. Intracrine VEGF Signaling Mediates the Activity of Prosurvival Pathways in Human Colorectal Cancer Cells. Cancer Research. 2016;76(10):3014–3024. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-15-1605.

7. Chen T. T., Filvaroff E., Peng J., Marsters S., Jubb A., Koeppen H., Merchant M., Ashkenazi A. MET Suppresses Epithelial VEGFR2 via Intracrine VEGF-induced Endoplasmic Reticulum-associated Degradation. EBioMedicine. 2015;2(5):406–420. DOI: 10.1016/j.ebiom.2015.03.021.

8. Fogli S., Del Re M., Rofi E., Posarelli C., Figus M., Danesi R. Clinical pharmacology of intravitreal anti-VEGF drugs. Eye (Lond). 2018;32(6):1010–1020. DOI: 10.1038/s41433-018-0021-7.

9. Wiszniak S., Schwarz Q. Exploring the Intracrine Functions of VEGF-A. Biomolecules. 2021;11(1):128. DOI: 10.3390/biom11010128.

10. Melincovici C. S., Boşca A. B., Şuşman S., Mărginean M., Mihu C., Istrate M., Moldovan I. M., Roman A. L., Mihu C. M. Vascular endothelial growth factor (VEGF) – key factor in normal and pathological angiogenesis. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 2018;59(2):455–467.

11. Kazemi-Lomedasht F., Behdani M., Pooshang Bagheri K., Habibi Anbouhi M., Abolhassani M., Khanahmad H., Shahbazzadeh D., Mirzahoseini H. Expression and purification of functional human vascular endothelial growth factor-A 121; the most important angiogenesis factor. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 2014;4(4):323–328. DOI: 10.5681/apb.2014.047.

12. Azimi-Nezhad M. Vascular endothelial growth factor from embryonic status to cardiovascular pathology. Reports of Biochemistry and Molecular Biology. 2014;2(2):59–69.

13. Liu H., Tang L. Mechano-regulation of alternative splicing. Current Genomics. 2013;14(1):49–55. DOI: 10.2174/138920213804999156.

14. Kinashi H., Ito Y., Sun T., Katsuno T., Takei Y. Roles of the TGF-β–VEGF-C Pathway in Fibrosis-Related Lymphangiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 2018;19(9):2487. DOI: 10.3390/ijms19092487.

15. Lecarpentier E., Tsatsaris V. Angiogenic balance (sFlt-1/PlGF) and preeclampsia. Annales d'Endocrinologie. 2016;77(2):97–100. DOI: 10.1016/j.ando.2016.04.007.

16. Cao Y., Langer R., Ferrara N. Targeting angiogenesis in oncology, ophthalmology and beyond. Nature Reviews Drug Discovery. 2023;22(6):476–495. DOI: 10.1038/s41573-023-00671-z.

17. Halmos B., Burke T., Kalyvas C., Vandormael K., Frederickson A., Piperdi B. Pembrolizumab+chemotherapy versus atezolizumab+chemotherapy+/-bevacizumab for the first-line treatment of non-squamous NSCLC: A matching-adjusted indirect comparison. Lung Cancer. 2021;155:175–182. DOI: 10.1016/j.lungcan.2021.03.020.

18. Kim K. J., Li B., Winer J., Armanini M., Gillett N., Phillips H. S., Ferrara N. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo. Nature. 1993;362(6423):841–844. DOI: 10.1038/362841a0.

19. Ferrara N., Adamis A. P. Ten years of anti-vascular endothelial growth factor therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 2016;15(6):385–403. DOI: 10.1038/nrd.2015.17.

20. Ellis L. M., Bevacizumab. Nature Reviews Drug Discovery. 2005;Suppl:S8–S9. DOI: 10.1038/nrd1727.

21. Di Filippo L. D., Dos Santos K. C., Hanck-Silva G., de Lima F. T., Daflon Gremião M. P., Chorilli M. A Critical Review of Biological Properties, Delivery Systems and Analytical/Bioanalytical Methods for Determination of Bevacizumab. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 2021;51(5):445–453. DOI: 10.1080/10408347.2020.1743641.

22. Surez I., Salmern-Garca A., Cabeza J., Capitn-Vallvey L. F., Navas N. Development and Use of Specific ELISA Methods for Quantifying the Biological Activity of Bevacizumab, Cetuximab and Trastuzumab in Stability Studies. Journal of Chromatography B. 2016;1032:155–142. DOI: 10.1016/j.jchromb.2016.05.045.

23. Kamerud J., Abrams M., Klover J. An ELISA for the Quantitative Determination of Free and Partially Bound Bevacizumab in Human Serum. Eurofins Bioanalytical Service. T2047. Available at: https://www.eurofins.com/media/12142677/eurofins-bioanalytical-services_2016-aaps-nbc_beva-poster-10may16_web.pdf. Accessed: 09.06.2023.

24. Pisarev V. V., Ivanov A. V. Validation of ELISA Test-system for Trastuzumab (Herceptin, Hertikad) quantitative determination in biological fluids. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2023;(1):58–64. (In Russ.) DOI: 10.37489/2587-7836-2023-1-58-64.

25. Pisarev V. V., Ivanov A. V. Validation of a test system based on solid-phase ELISA to assess the pharmacokinetics of etanercept. Pharmaceutical Chemistry Journal. Available at: https://www.probiotech.ru/images/articles/ELISA%20etanercept%20Probiotech%202023.pdf. Accessed: 09.06.2023.

26. Han K., Peyret T., Quartino A., Gosselin N. H., Gururangan S., Casanova M., Merks J. H. M., Massimino M., Grill J., Daw N. C., Navid F., Jin J., Allison D. E. Bevacizumab dosing strategy in paediatric cancer patients based on population pharmacokinetic analysis with external validation. British Journal of Clinical Pharmacology. 2016;81(1):148–160. DOI: 10.1111/bcp.12778.

27. Han K., Peyret T., Marchand M., Quartino A., Gosselin N. H., Girish S., Allison D. E., Jin J. Population pharmacokinetics of bevacizumab in cancer patients with external validation. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 2016;78(2):341–351. DOI: 10.1007/s00280-016-3079-6.

28. Findlay J. W. A., Dillard R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. The AAPS Journal. 2007;9(2):29. DOI: 10.1208/aapsj0902029.