Идентификация метаболитов лютеолин-7-глюкозида после перорального введения и разработка методики их количественного анализа

Введение. Разработка и регистрация противовирусных препаратов является актуальной задачей. Флавоноиды, в частности лютеолин-7-гликозид (цинарозид, лютеолин-7-О-гликозид), демонстрируют высокую противовирусную активность широкого спектра in vitro, а промышленный регламент получения лютеолин-7-гликозида из листьев ивы остролистной уже разработан в ФГБНУ ВИЛАР. Одной из проблем при внедрении флавоноидов в медицинскую практику является их низкая биодоступность и интенсивная биотрансформация. Существующие публикации приводят противоречивые данные по фармакокинетике лютеолин-7-гликозида, в связи с чем было проведено собственное исследование.

Цель. Разработать методику количественного анализа лютеолин-7-гликозида и его метаболитов в плазме крови и апробировать ее на лабораторных животных.

Материалы и методы. Эксперименты на животных проводили согласно требованиям «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств». Для разработки методики анализа и дальнейшего уточнения временных интервалов отбора проб крови анализировали временные точки: через 30, 60 минут, 2, 4, 8, 24 часа после введения исследуемого вещества. Пробирки с цитратной кровью лабораторных животных центрифугировали при 2000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Плазму помещали в пробирку типа «эппендорф», замораживали и хранили при температуре –20 °С до проведения хроматографического анализа. Пробоподготовку плазмы крови проводили методом осаждения метиловым спиртом, супернатант хроматографически разделяли на колонке Luna® С18 100 Å, 250 × 4,6 мм, 5 мкм, в градиентном режиме в системе «вода – ацетонитрил» и модификатором – 0,2%-й муравьиной кислотой. Метаболиты идентифицировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Для этого интерпретировали спектральные характеристики пиков, которые появились на хроматограммах образцов плазмы крови после перорального введения лютеолин-7-гликозида. Концентрацию анализируемых веществ оценивали методом внутреннего стандарта, в качестве которого выступал рутин. Для определения концентрации лютеолина в качестве стандартного образца использовали стандартизированную субстанцию лютеолина, концентрацию остальных метаболитов оценивали в пересчете на лютеолин.

Результаты и обсуждение. Удалось установить, что после перорального введения лабораторным животным лютеолин-7-гликозида в крахмальном клейстере нативный лютеолин-7-гликозид в плазме крови не обнаруживается. Основными метаболитами являлись лютеолин-диглюкуронид и лютеолин-глюкуронид, их максимальные концентрации в плазме почти в три раза выше, чем концентрации лютеолина и метиллютеолина-диглюкуронида. Результаты сопоставлены с данными других исследований.

Заключение. Отсутствие в плазме крови нативного лютеолин-7-гликозида после перорального введения требует пересмотра адекватности выводов, полученных при исследованиях его активности в опытах in vitro. Вместе с тем наличие противовирусной активности in vivo обуславливает необходимость проведения дальнейших исследований для установления реальных механизмов действия данной лекарственной субстанции.

1. Lin L.-C., Pai Y.-F., Tsai T.-H. Isolation of luteolin and luteolin-7-O-glucoside from Dendranthema morifolium Ramat Tzvel and their pharmacokinetics in rats. Journal of agricultural and food chemistry. 2015;63(35):7700–7706. DOI: 10.1021/jf505848z.

2. Макарова М. Н. Биодоступность и метаболизм флавоноидов. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2011;74(6):33–40. DOI: 10.30906/0869-2092-2011-74-6-33-40.

3. Shimoi K. Okada H., Furugori M., Goda T., Takase S., Suzuki M., Hara Yu., Yamamoto H., Kinae N. Intestinal absorption of luteolin and luteolin 7-O-β-glucoside in rats and humans. FEBS letters. 1998;438(3):220–224. DOI: 10.1016/S0014-5793(98)01304-0.

4. Cui X. X., Yang X., Wang H.-J., Rong X.-Y., Jing S., Xie Y.-H., Huang D.-F., Zhao C. Luteolin-7-O-glucoside present in lettuce extracts inhibits hepatitis B surface antigen production and viral replication by human hepatoma cells in vitro. Frontiers in Microbiology. 2017;8:2425. DOI: 10.3389/fmicb.2017.02425.

5. Caporali S., De Stefano A., Calabrese C., Giovannelli A., Pieri M., Savini I., Tesauro M., Bernardini S., Minieri M., Terrinoni A. Anti-inflammatory and active biological properties of the plant-derived bioactive compounds luteolin and luteolin 7-glucoside. Nutrients. 2022;14(6):1155. DOI: 10.3390/nu14061155.

6. Mabry T. J., Markham K. R., Thomas M. B. The systematic identification of flavonoids. New York: Springer Science & Business Media; 2012. P. 40.

7. Быков В. А., Дубинская В. А., Ребров Л. Б., Минеева М. Ф., Скуридин С. Г., Евдокимов Ю. М. Комплексный подход к изучению механизмов действия противомикробных и противовирусных средств. Химико-фармацевтический журнал. 2008;42(3):3–8. DOI: 10.30906/0023-1134-2008-42-3-3-8.

8. Миронов А. Н., ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К; 2012. С. 843–853.

9. Theoharides T. C. COVID-19, pulmonary mast cells, cytokine storms, and beneficial actions of luteolin. BioFactors. 2020;46(3):306–308. DOI: 10.1002/biof.1633.

10. Fan W., Qian S., Qian P., Li X. Antiviral activity of luteolin against Japanese encephalitis virus. Virus Research. 2016;220:112–116. DOI: 10.1016/j.virusres.2016.04.021.

11. Theerawatanasirikul S., Thangthamniyom N., Kuo C.-J., Semkum P., Phecharat N., Chankeeree P., Lekcharoensuk P. Natural phytochemicals, luteolin and isoginkgetin, inhibit 3C protease and infection of FMDV, in silico and in vitro. Viruses. 2021;13(11):2118. DOI: 10.3390/v13112118.

12. Wu S., Wang H.-Q., Guo T.-T., Li Y.-H. Luteolin inhibits CVB3 replication through inhibiting inflammation. Journal of Asian natural products research. 2020;22(8)762–773. DOI: 10.1080/10286020.2019.1642329.

13. Yan H., Ma L., Wang H., Wu S., Huang H., Gu Z., Jiang J., Li Yu. Luteolin decreases the yield of influenza A virus in vitro by interfering with the coat protein I complex expression. Journal of Natural Medicines. 2019;73:487–496. DOI: 10.1007/s11418-019-01287-7.

14. Wang S., Ling Y., Yao Yu., Zheng G., Chen W. Luteolin inhibits respiratory syncytial virus replication by regulating the MiR-155/SOCS1/STAT1 signaling pathway. Virology Journal. 2020;17:187. DOI: 10.1186/s12985-020-01451-6.

15. Men X., Li S., Cai X., Fu L., Shao Y., Zhu Y. Antiviral activity of luteolin against Pseudorabies virus in vitro and in vivo. Animals. 2023;13(4):761. DOI: 10.3390/ani13040761.

16. Jia Q., Huang X., Yao G., Ma W., Shen J., Changm Y., Ouyangm H., He J. Pharmacokinetic Study of Thirteen Ingredients after the Oral Administration of Flos Chrysanthemi Extract in Rats by UPLC-MS/MS. BioMed Research International. 2020;2020(1):8420409. DOI: 10.1155/2020/8420409.

17. Xu Z.-L., Xu M.-Y., Wang H.-T., Xu Q.-X., Liu M.-Y., Jia C.-P., Geng F., Zhang N. Pharmacokinetics of eight flavonoids in rats assayed by UPLC-MS/MS after Oral Administration of Drynariae rhizoma extract. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2018;2018(1):4789196. DOI: 10.1155/2018/4789196.

18. Гуленков А. С., Мизина П. Г., Бахрушина Е. О., Бардаков А. И., Нюдочкин А. В. Фармацевтико-технологическое исследование адсорбированного жидкого растительного экстракта антимикробного действия. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(2):94–101. DOI: 10.33380/2305-2066-2022-11-2-94-101.

19. Гуленков А. С., Мизина П. Г. Сорбция и десорбция жидкого растительного экстракта. Фармация. 2019;68(4):27–31. DOI: 10.29296/25419218-2019-04-04.

20. Rezaei A., Varshosaz J., Fesharaki M., Farhang A., Jafari S. M. Improving the solubility and in vitro cytotoxicity (anticancer activity) of ferulic acid by loading it into cyclodextrin nanosponges. International Journal of Nanomedicine. 2019;14:4589–4599. DOI: 10.2147/IJN.S206350.

21. Deng C., Gao C., Tian X., Chao B., Wang F., Zhang Y., Zou J., Liu D. Pharmacokinetics, tissue distribution and excretion of luteolin and its major metabolites in rats: Metabolites predominate in blood, tissues and are mainly excreted via bile. Journal of Functional Foods. 2017;35:332–340. DOI: 10.1016/j.jff.2017.05.056.