Разработка и валидация методики количественного определения 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов в плазме лабораторных животных

Введение. Изучение системной экспозиции нового оригинального лекарственного препарата является обязательным этапом его доклинического исследования. 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид является новым селективным ингибитором карбоангидразы II для лечения открытоугольной глаукомы. Методики количественного определения данного соединения и его N-гидрокси- и N-ацетилметаболитов в плазме лабораторных животных ранее разработаны не были.

Цель. Разработка и валидация методики количественного определения 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида (М₁) и N-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида (М₂) в плазме крови крысы и кролика методом ВЭЖХ-МС/МС.

Материалы и методы. Для пробоподготовки применялось осаждение белков метанолом. В качестве внутреннего стандарта использован 5-[2-(морфолин-4-карбонил)-1,3-оксазол-5-ил]-тиофен-2-сульфонамид. К пробам плазмы добавлялся 5%-й водный раствор аскорбиновой кислоты в объемном соотношении 1 : 2 для предотвращения разложения N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида. В качестве антикоагулянта выбрана комбинация натрия фторида и калия оксалата. Хроматографическое разделение проводили на колонке Zorbax Eclipse Plus C18 (150 × 3,0 мм, 3,5 мкм) с предколонкой Zorbax Eclipse Plus C18 (12,5 × 2,1 мм, 5,0 мкм) с применением подвижной фазы на основе 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты и метанола. Масс-спектрометрическое детектирование осуществляли в режиме MRM с использованием электрораспылительной ионизации в отрицательной полярности. Апробацию методики проводили во время фармакокинетического исследования 1%-й глазной суспензии 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида на 6 крысах линии Wistar. Образцы крови отбирали до введения, а также спустя 30 мин, 1 ч, 1ч 30 мин, 2 ч, 3 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч,144 ч, 216 ч после введения. Некомпартментный подход использовался для расчета фармакокинетических параметров.

Результаты и обсуждение. Разработанная методика прошла валидацию по показателям «селективность», «калибровочная кривая», «правильность и прецизионность», «эффект матрицы», «эффект разведения», «эффект переноса из предыдущей пробы», «воспроизводимость при повторном введении серии», «стабильность». Аналитический диапазон определения в плазме 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида составил 10–4000 нг/мл, М₁ – 1,0–400,0 нг/мл, М₂ – 0,1–40,0 нг/мл. Выбранная комбинация антикоагулянта и раствора стабилизатора позволяет хранить образцы плазмы в течение 28 дней в морозильной камере.

Заключение. Разработанная методика в ходе проведённой валидации подтвердила свою пригодность для количественного определения 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов в плазме крови лабораторных животных. Данная методика успешно использована при исследовании фармакокинетики 1%-й глазной суспензии изучаемого препарата.

1. Kurysheva N. I. Carbonic Anhydrase Inhibitors in the Treatment of Glaucoma. Review. Part II. Ophthalmology in Russia. 2020;17(4):676–682. (In Russ.) DOI: 10.18008/1816-5095-2020-4-676-682.

2. Popovic M. M., Schlenker M. B., Thiruchelvam D., Redelmeier D. A. Serious Adverse Events of Oral and Topical Carbonic Anhydrase Inhibitors. JAMA Ophthalmology. 2022;140(3):235–242. DOI: 10.1001/jamaophthalmol.2021.5977.

3. Khokhlov A. L., Shetnev A. A., Korsakov M. K., Fedorov V. N., Tyushina A. N., Volkhin N. N., Vdovichenko V. P. Pharmacological properties of sulfonamide derivatives – new inhibitors of carbonic anhydrase. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2023;175(2):166–170. (In Russ.) DOI: 10.47056/0365-9615-2023-175-2-166-170.

4. Lo Faro A. F., Tini A., Gottardi M., Pirani F., Sirignano A., Giorgetti R., Busard F. P. Development and validation of a fast ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for determining carbonic anhydrase inhibitors and their metabolites in urine and hair. Drug Testing and Analysis. 2021;13(8):1552–1560. DOI: 10.1002/dta.3055.

5. Madrewar A. B., Deshpande A., Bhattacharya S. Mini-Review on Bioanalytical Estimation of Brinzolamide. Current Pharmaceutical Analysis. 2022;18(3):265–272. DOI: 10.2174/1573412917666210812103414.

6. Khokhlov A. L., Yaichkov I. I., Shetnev A. А., Ivanovsky S. A., Korsakov M. K., Alexeev M. A., Gasilina O. A., Volkhin N. N., Petukhov S. S. Identification and synthesis of metabolites of the new antiglaucoma drug. Research Results in Pharmacology. 2024;10(1):53–66. DOI: 10.18413/rrpharmacology.10.431.

7. Raghuvanshi D. S., Verma N. An iodine-mediated new avenue to sulfonylation employing N-hydroxy aryl sulfonamide as a sulfonylating agent. Organic & Biomolecular Chemistry. 2021;19:4760–4767. DOI: 10.1039/d1ob00036e.

8. Wang F.-X., Zhou S.-D., Wang C., Tian S.-K. N-Hydroxy sulfonamides as new sulfenylating agents for the functionalization of aromatic compounds. Organic & Biomolecular Chemistry. 2017;15(25):5284–5288. DOI: 10.1039/c7ob01390f.

9. Khokhlov A. L., Yaichkov I. I., Korsakov M. K., Shetnev A. A., Volkhin N. N., Petukhov S. S. Development of quantification methods of a new selective carbonic anhydrase II inhibitor in plasma and blood and study of the pharmacokinetics of its ophthalmic suspension in rats. Research Results in Pharmacology. 2023;9(4):53–64. DOI: 10.18413/rrpharmacology.9.10056.