Экспериментальный неалкогольный стеатогепатит у мышей ассоциирован с поведенческими, когнитивными и периферическими нейрональными нарушениями

Введение. Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) и неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) – на сегодняшний день ведущая причина хронической патологии печени во всем мире – ассоциированы с широким спектром психоневрологических осложнений и заболеваний. Тем не менее в настоящий момент аспекты причинно-следственной связи между патологией печени и нервной системы изучены не до конца, что обусловливает необходимость разработки соответствующих клинически релевантных и валидных животных моделей.

Цель. Целью настоящей работы стала оценка кратко- и долгосрочных психоневрологических и периферических нейрональных нарушений, осложняющих течение различных стадий НАЖБП/НАСГ у мышей.

Материалы и методы. 68 взрослых мышей-самцов линии C57Bl/6 рандомизировали на группы «Контроль» и «НАСГ». НАСГ моделировали в течение 3 (эксперимент 1) или 6 (эксперимент 2) мес. при помощи комбинированной модели, включающей высокожировую диету и введение низких доз тетрахлорметана. Контрольные животные получали стандартный комбикорм, питьевую воду и физиологический раствор в эквивалентных объемах. Поведение животных оценивали через 1, 2, 3 и 6 мес индукции НАСГ в тестах «Открытое поле» (ОП), «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) и «Черно-белая камера» (ЧБК). Визуально-пространственную память оценивали с помощью тестов «Спонтанное чередование в Т-лабиринте» и «Распознавание нового объекта» через 1, 2 и 3 мес. индукции НАСГ, а также с помощью теста «Лабиринт Барнс» через 6 мес. индукции НАСГ. Через 3 мес. моделирования НАСГ выполняли игольчатую электронейромиографию (ЭНМГ) икроножной мышцы и двуглавой мышцы плеча при электрической стимуляции седалищного и мышечнокожного нервов соответственно. Патологию печени верифицировали гистоморфологически. Статистическую обработку данных проводили в программе Prism 10.2.3 и среде R 4.2.3 с RStudio 2024.09.0.

Результаты и обсуждение. Экспериментальное моделирование сопровождалось снижением общей выживаемости животных (p < 0,05, p < 0,01) и признаками выраженного поражения печени, включая холестатический гепатит, средне- и крупнокапельный стеатоз, очаги некроза и фиброз различной степени тяжести (p < 0,05, p < 0,01). Мыши с НАСГ демонстрировали признаки повышения тревожности в тестах ОП, ПКЛ и ЧБК (p < 0,05, p < 0,01), которые были наиболее выражены на самых начальных (1 мес.) и более поздних (6 мес.) стадиях болезни. НАСГ был также ассоциирован со значительным снижением частоты спонтанного чередования в 3 мес. (p < 0,01), отрицательной дискриминацией объектов в 2 мес. (p < 0,05) и ухудшением ретенции памятного следа в «Лабиринте Барнс» (p < 0,05, p < 0,01) по сравнению с контролем. При проведении ЭНМГ в икроножной мышце у мышей с НАСГ наблюдали значительное снижение максимальной амплитуды М-ответа (p < 0,01) и пороговой силы тока (p < 0,05), в двуглавой мышце плеча – увеличение латентности максимального ответа (p < 0,05).

Заключение. Экспериментальный алиментарно-токсический НАСГ у мышей-самцов линии C57Bl/6 ассоциирован с повышением тревожности, нарушением формирования и ретенции визуально-пространственного памятного следа, а также признаками аксонально-демиелинизирующей периферической моторной нейропатии.

1. Rinella M. E., Sookoian S. From NAFLD to MASLD: updated naming and diagnosis criteria for fatty liver disease. Journal of Lipid Research. 2024;65(1):100485. DOI: 10.1016/j.jlr.2023.100485.

2. Amini-Salehi E., Letafatkar N., Norouzi N., Joukar F., Habibi A., Javid M., Sattari N., Khorasani M., Farahmand A., Tavakoli S., Masoumzadeh B., Abbaspour E., Karimzad S., Ghadiri A., Maddineni G., Khosousi M. J., Faraji N., Keivanlou M.-H., Mahapatro A., Gaskarei M. A. K., Okhovat P., Bahrampourian A., Aleali M. S., Mirdamadi A., Eslami N., Javid M., Javaheri N., Pra S. V., Bakhsi A., Shafipour M., Vakilpour A., Ansar M. M., Kanagala S. G., Hashemi M., Ghazalgoo A., Kheirandish M., Porteghali P., Heidarzad F., Zeinali T., Ghanaei F. M., Hassanipour S., Ulrich M. T., Melson J. E., Patel D., Nayak S. S. Global Prevalence of Nonalcoholic Fatty Liver Disease: An Updated Review Meta-Analysis comprising a Population of 78 million from 38 Countries. Archives of Medical Research. 2024;55(6):103043. DOI: 10.1016/j.arcmed.2024.103043.

3. Younossi Z. M., Golabi P., Paik J. M., Henry A., Van Dongen C., Henry L. The global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) and nonalcoholic steatohepatitis (NASH): a systematic review. Hepatology. 2023;77(4):1335–1347. DOI: 10.1097/HEP.0000000000000004.

4. Prikhodko V. A., Okovity S. V. Neuropsychiatric disorders of non-alcoholic fatty liver disease. Therapy. 2022;8(7):64–77. DOI: 10.18565/therapy.2022.7.64-77.

5. Lin Y.-K., Cai X.-R., Chen J.-Z., Hong H.-J., Tu K., Chen Y.-L., Du Q. Non-alcoholic fatty liver disease causally affects the brain cortical structure: a Mendelian randomization study. Frontiers in Neuroscience. 2024;17:1305624. DOI: 10.3389/fnins.2023.1305624.

6. Prikhodko V. A., Sysoev Yu. I., Poveryaeva M. A., Bunyat A. V., Karev V. E., Ivkin D. Yu., Sukhanov D. S., Shustov E. B, Okovityi S. V. Effects of empagliflozin and L-ornithine L-aspartate on behavior, cognitive functions, and physical performance in mice with experimentally induced steatohepatitis. Bulletin of Russian State Medical University. 2020;3:53–62. DOI: 10.24075/brsmu.2020.034.

7. Prikhodko V. A. Effects of Ornithine Aspartate and Empagliflozin on Memory Deficit Symptoms in Experimental Steatohepatitis. Journal Biomed. 2022;18(2):128–132. DOI: 10.33647/2074-5982-18-3-128-132.

8. Tsuchida T., Lee Y. A., Fujiwara N., Ybanez M., Allen B., Martins S., Fiel M. I., Goossens N., Chou H. I., Hoshida Y., Friedman S. L. A simple diet- and chemical-induced murine NASH model with rapid progression of steatohepatitis, fibrosis and liver cancer. Journal of Hepatology. 2018;69(2):385–395. DOI: 10.1016/j.jhep.2018.03.011.

9. Walsh R. N., Cummins R. A. The Open-Field Test: A Critical Review. Psychological Bulletin. 1976;83:482–504.

10. Walf A. A., Frye C. A. The Use of the Elevated plus Maze as an Assay of Anxiety-Related Behavior in Rodents. Nature Protocols. 2007;2:322–328. DOI: 10.1038/nprot.2007.44.

11. Bourin M., Hascoët M. The Mouse Light/Dark Box Test. European Journal of Pharmacology. 2003;463:55–65. DOI: 10.1016/s0014-2999(03)01274-3.

12. Deacon R. M., Rawlins J. N. T-maze alternation in the rodent. Nature Protocols. 2006;1(1):7–12. DOI: 10.1038/nprot.2006.2.

13. Leger M., Quiedeville A., Bouet V., Haelewyn B., Boulouard M., Schumann-Bard P., Freret T. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 2013;8(12):2531–2537. DOI: 10.1038/nprot.2013.155.

14. Barnes C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 1979;93(1):74–104. DOI: 10.1037/h0077579.

15. Pollari E., Prior R., Robberecht W., Van Damme P., Van Den Bosch L. In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration. Journal of Visualized Experiments. 2018;(136):57741. DOI: 10.3791/57741.

16. Bedossa P., Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. The METAVIR Cooperative Study Group. Hepatology. 1996;24(2):289–293. DOI: 10.1002/hep.510240201.

17. Prikhodko V. A., Karev V. E., Sysoev Yu. I., Ivkin D. Yu., Okovityi S. V. A Simple Algorithm for Semiquantitative Analysis of Scored Histology Data in the R Environment, on the Example of Murine Non-Alcoholic Steatohepatitis Pharmacotherapy. Livers. 2022;2:412–424. DOI: 10.3390/livers2040031.

18. Costall B., Jones B. J., Kelly M. E., Naylor R. J., Tomkins D. M. Exploration of mice in a black and white test box: validation as a model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 1989;32(3):777–785. DOI: 10.1016/0091-3057(89)90033-6.

19. Seibenhener M. L., Wooten M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. 2015;(96):e52434. DOI: 10.3791/52434.

20. Simon P., Dupuis R., Costentin J. Thigmotaxis as an index of anxiety in mice. Influence of dopaminergic transmissions. Behavioural Brain Research. 1994;61(1):59–64. DOI: 10.1016/0166-4328(94)90008-6.

21. Tucker L. B., McCabe J. T. Measuring Anxiety-Like Behaviors in Rodent Models of Traumatic Brain Injury. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 2021;15:682935. DOI: 10.3389/fnbeh.2021.682935.

22. Díaz-Morán S., Estanislau C., Cañete T., Blázquez G., Ráez A., Tobeña A., Fernández-Teruel A. Relationships of open-field behaviour with anxiety in the elevated zero-maze test: Focus on freezing and grooming. World Journal of Neuroscience. 2014;4(1):1–11. DOI: 10.4236/wjns.2014.41001.

23. Eudave D. M., BeLow M. N., Flandreau E. I. Effects of high fat or high sucrose diet on behavioral-response to social defeat stress in mice. Neurobiology of Stress. 2018;9:1–8. DOI: 10.1016/j.ynstr.2018.05.005.

24. Kalueff A. V., Tuohimaa P. Grooming analysis algorithm for neurobehavioural stress research. Brain Research Protocols. 2004;13(3):151–158. DOI: 10.1016/j.brainresprot.2004.04.002.

25. Kalueff A. V., Keisala T., Minasyan A., Kuuslahti M., Tuohimaa P. Temporal stability of novelty exploration in mice exposed to different open field tests. Behavioural Processes. 2006;72(1):104–112. DOI: 10.1016/j.beproc.2005.12.011.

26. Augustsson H., Meyerson B. J. Exploration and risk assessment: a comparative study of male house mice (Mus musculus musculus) and two laboratory strains. Physiology & Behavior. 2004;81(4):685–698. DOI: 10.1016/j.physbeh.2004.03.014.

27. Sestakova N., Puzserova A., Kluknavsky M., Bernatova I. Determination of motor activity and anxiety-related behaviour in rodents: methodological aspects and role of nitric oxide. Interdisciplinary Toxicology. 2013;6(3):126–135. DOI: 10.2478/intox-2013-0020.

28. Aduema W., Osim E. E., Nwankwo A. A. Using the elevated plusmaze task in assessing anxiety and fear in swiss white mice. Journal of Complementary Medicine & Alternative Healthcare. 2018;6(1):555678.

29. Strekalova T., Evans M., Costa-Nunes J., Bachurin S., Yeritsyan N., Couch Y., Steinbusch H. M. W., Eleonore Köhler S., Lesch K.-P., Anthony D. C. Tlr4 upregulation in the brain accompanies depressionand anxiety-like behaviors induced by a high-cholesterol diet. Brain, Behavior, and Immunity. 2015;48:42–47. DOI: 10.1016/j.bbi.2015.02.015.

30. Morris R. G. M., Anderson E., Lynch G. S., Baudry M. Selective impairment of learning and blockade of long-term potentiation by an N-methyl-D-aspartate receptor antagonist, AP5. Nature. 1986;319(6056):774–776. DOI: 10.1038/319774a0.

31. Morris R. G. M., Schenk F., Tweedie F., Jarrard L. E. Ibotenate Lesions of Hippocampus and/or Subiculum: Dissociating Components of Allocentric Spatial Learning. European Journal of Neuroscience. 1990;2(12):1016–1028. DOI: 10.1111/j.1460-9568.1990.tb00014.x.

32. Higarza S. G., Arboleya S., Gueimonde M., Gómez-Lázaro E., Arias J. L., Arias N. Neurobehavioral dysfunction in non-alcoholic steatohepatitis is associated with hyperammonemia, gut dysbiosis, and metabolic and functional brain regional deficits. PLoS One. 2019;14(9):e0223019. DOI: 10.1371/journal.pone.0223019.

33. Ross A. P., Bruggeman E. C., Kasumu A. W., Mielke J. G., Parent M. B. Non-alcoholic fatty liver disease impairs hippocampal-dependent memory in male rats. Physiology & Behavior. 2012;106(2):133–141. DOI: 10.1016/j.physbeh.2012.01.008.

34. Filipović B., Marković O., Đurić V., Filipović B. Cognitive Changes and Brain Volume Reduction in Patients with Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Canadian Journal of Gastroenterology and Hepatology. 2018;2018:9638797. DOI: 10.1155/2018/9638797.

35. Nucera S., Ruga S., Cardamone A., Coppoletta A. R., Guarnieri L., Zito M. C., Bosco F., Macrì R., Scarano F., Scicchitano M., Maiuolo J., Carresi C., Mollace R., Cariati L., Mazzarella G., Palma E., Gliozzi M., Musolino V., Cascini G. L., Mollace V. MAFLD progression contributes to altered thalamus metabolism and brain structure. Scientific Reports. 2022;12(1):1207. DOI: 10.1038/s41598-022-05228-5.

36. Kim D.-G., Krenz A., Toussaint L. E., Maurer K. J., Robinson S.-A., Yan A., Torres L., Bynoe M. S. Non-alcoholic fatty liver disease induces signs of Alzheimer’s disease (AD) in wild-type mice and accelerates pathological signs of AD in an AD model. Journal of Neuroinflammation. 2016;13:1. DOI: 10.1186/s12974-015-0467-5.

37. Colognesi M., Gabbia D., De Martin S. Depression and Cognitive Impairment-Extrahepatic Manifestations of NAFLD and NASH. Biomedicines. 2020;8(7):229. DOI: 10.3390/biomedicines8070229.

38. Ghareeb D. A., Hafez H. S., Hussien H. M., Kabapy N. F. Non-alcoholic fatty liver induces insulin resistance and metabolic disorders with development of brain damage and dysfunction. Metabolic Brain Disease. 2011;26(4):253–267. DOI: 10.1007/s11011-011-9261-y.

39. Mohammed S. K., Magdy Y. M., El-Waseef D. A., Nabih E. S., Hamouda M. A., El-Kharashi O. A. Modulation of hippocampal TLR4/BDNF signal pathway using probiotics is a step closer towards treating cognitive impairment in NASH model. Physiology & Behavior. 2020;214:112762. DOI: 10.1016/j.physbeh.2019.112762.

40. An K., Starkweather A., Sturgill J., Salyer J., Sterling R. K. Association of CTRP13 With Liver Enzymes and Cognitive Symptoms in Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Nursing Research. 2019;68(1):29–38. DOI: 10.1097/NNR.0000000000000319.

41. Celikbilek A., Celikbilek M., Bozkurt G. Cognitive assessment of patients with nonalcoholic fatty liver disease. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 2018;30(8):944–950. DOI: 10.1097/MEG.0000000000001131.

42. Felipo V., Urios A., Montesinos E., Molina I., Garcia-Torres M. L., Civera M., Olmo J. A., Ortega J., Martinez-Valls J., Serra M. A., Cassinello N., Wassel A., Jordá E., Montoliu C. Contribution of hyperammonemia and inflammatory factors to cognitive impairment in minimal hepatic encephalopathy. Metabolic Brain Disease. 2012;27(1):51–58. DOI: 10.1007/s11011-011-9269-3.

43. Tarter R. E., Hegedus A. M., Van Thiel D. H., Schade R. R., Gavaler J. S., Starzl T. E. Nonalcoholic cirrhosis associated with neuropsychological dysfunction in the absence of overt evidence of hepatic encephalopathy. Gastroenterology. 1984;86(6):1421–1427.

44. Broadbent N. J., Squire L. R., Clark R. E. Spatial memory, recognition memory, and the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2004;101(40):14515–14520. DOI: 10.1073/pnas.0406344101.

45. Chung T., Prasad K., Lloyd T. E. Peripheral neuropathy: clinical and electrophysiological considerations. Neuroimaging Clinics of North America. 2014;24(1):49–65. DOI: 10.1016/j.nic.2013.03.023.

46. Chaudhry V., Corse A. M., O’Brian R., Cornblath D. R., Klein A. S., Thuluvath P. J. Autonomic and peripheral (sensorimotor) neuropathy in chronic liver disease: a clinical and electrophysiologic study. Hepatology. 1999;29(6):1698–1703. DOI: 10.1002/hep.510290630.

47. Kharbanda P. S., Prabhakar S., Chawla Y. K., Das C. P., Syal P. Peripheral neuropathy in liver cirrhosis. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 2003;18(8):922–926. DOI: 10.1046/j.1440-1746.2003.03023.x.

48. Jain J., Singh R., Banait S., Verma N., Waghmare S. Magnitude of peripheral neuropathy in cirrhosis of liver patients from central rural India. Annals of Indian Academy of Neurology. 2014;17(4):409–415. DOI: 10.4103/0972-2327.144012.

49. Sun W., Zhang D., Sun J., Xu B., Sun K., Wang T., Ren C., Li J., Chen Y., Xu M., Bi Y., Xu Q., Wang W., Gu Y., Ning G. Association between non-alcoholic fatty liver disease and autonomic dysfunction in a Chinese population. QJM. 2015;108(8):617–624. DOI: 10.1093/qjmed/hcv006.

50. Greco C., Nascimbeni F., Carubbi F., Andreone P., Simoni M., Santi D. Association of Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) with Peripheral Diabetic Polyneuropathy: A Systematic Review and Meta-Analysis. Journal of Clinical Medicine. 2021;10(19):4466. DOI: 10.3390/jcm10194466.