Автоматизированный количественный анализ окраса шерстного и кожного покрова лабораторных животных

Введение. Анализ окраса шерстного и кожного покрова животных может использоваться как вспомогательный неинвазивный инструмент оценки ряда состояний и процессов, сопровождающихся изменением его цветности, насыщенности, долевого соотношения цветов шерсти или участков шерсти, подшерстка и кожи. Для проведения анализа окраса в условиях доклинических исследований требуется разработка простых, быстрых и легко стандартизуемых цифровых методов, обеспечивающих получение воспроизводимых результатов, пригодных для статистической обработки.

Цель. Целью настоящей работы стали разработка и апробация алгоритма количественного анализа окраса шерстного и кожного покрова лабораторных животных с использованием языка программирования R.

Материалы и методы. Для анализа шерстного покрова использовали цифровые фотоснимки самок морской свинки двух- и трехцветного окраса, сделанные в условиях искусственного освещения на однотонном контрастном фоне. Анализ соотношения участков шерсти и кожи выполняли с повторным использованием фотоснимков самца мыши с депиляционной моделью алопеции, сделанных в рамках ранее опубликованного доклинического исследования. Колориметрический анализ изображений осуществляли путем иерархической кластеризации цветов методом k-средних в пространстве RGB с расчетом площади кластеров с помощью пакета функций recolorize v0.2.0 для R v4.2.3 с RStudio v2025.05.0.

Результаты и обсуждение. Алгоритм колориметрического анализа включил три стадии: 1) преаналитическая обработка изображения и маскирование фона; 2) иерархическая кластеризация и рекластеризация цветов; 3) измерение абсолютных и относительных площадей цветовых кластеров. Посредством применения описанного алгоритма долевое соотношение цветов в окрасе двухцветной морской свинки было определено как 46,1 % агути и 53,9 % желтого; трехцветной – как 9,1 % рыжего, 19,6 % белого и 71,3 % черного. Для самца мыши после депиляции была охарактеризована динамика долевого соотношения участков кожи без волос и с растущими волосами в течение 28-дневного периода. Между 0-м, 9-м и 17-м днями после депиляции наблюдали сокращение относительной площади лишенной шерсти кожи от 8,7 до 7,4 и до 0,0 % соответственно (p < 0,05 для 17-го дня против 0-го и 9-го).

Заключение. В ходе проведенной работы описан и апробирован на модельных фотоснимках алгоритм количественного анализа окраса шерстного и кожного покрова с применением метода иерархической кластеризации цветов. Описанный алгоритм не требует использования специализированного программного обеспечения, быстр и прост в применении, подходит для серийной обработки изображений с получением количественных данных для дальнейшего статистического анализа.

1. Caro T., Mallarino R. Coloration in Mammals. Trends in Ecology and Evolution. 2020;35(4):357–366. DOI: 10.1016/j.tree.2019.12.008.

2. Rochin L., Hurbain I., Serneels L., Fort C., Watt B., Leblanc P., Marks M. S., De Strooper B., Raposo G., van Niel G. BACE2 processes PMEL to form the melanosome amyloid matrix in pigment cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013;110(26):10658–10663. DOI: 10.1073/pnas.1220748110.

3. Tharmarajah G., Faas L., Reiss K., Saftig P., Young A., Van Raamsdonk C. D. Adam10 haploinsufficiency causes freckle-like macules in Hairless mice. Pigment Cell and Melanoma Research. 2012;25(5):555–565. DOI: 10.1111/j.1755-148X.2012.01032.x.

4. Papalazarou V., Swaminathan K., Jaber-Hijazi F., Spence H., Lahmann I., Nixon C., Salmeron-Sanchez M., Arnold H.-H., Rottner K., Machesky L. M. The Arp2/3 complex is critical for colonisation of the mouse skin by melanoblasts. Development. 2020;147(22):dev194555. DOI: 10.1242/dev.194555.

5. Fan R., Gao J. Establishment of a promising vitiligo mouse model for pathogenesis and treatment studies. Diagnostic Pathology. 2024;19(1):92. DOI: 10.1186/s13000-024-01520-2.

6. Lenartowicz M., Krzeptowski W., Lipiński P., Grzmil P., Starzyński R., Pierzchała O., Møller L. B. Mottled Mice and Non-Mammalian Models of Menkes Disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 2015;8:72. DOI: 10.3389/fnmol.2015.00072.

7. Sundberg J. P., Wang E. H. C., McElwee K. J. Current Protocols: Alopecia Areata Mouse Models for Drug Efficacy and Mechanism Studies. Current Protocols. 2024;4(8):e1113. DOI: 10.1002/cpz1.1113.

8. Shipkowski K. A., Hubbard T. D., Ryan K., Waidyanatha S., Cunny H., Shockley K. R., Allen J. L., Toy H., Levine K., Harrington J., Betz L., Sparrow B., Roberts G. K. Shortterm toxicity studies of thallium (I) sulfate administered in drinking water to Sprague Dawley rats and B6C3F1/N mice. Toxicology Reports. 2023;10:621–632. DOI: 10.1016/j.toxrep.2023.05.003.

9. Chen C. C., Murray P. J., Jiang T. X., Plikus M. V., Chang Y. T., Lee O. K., Widelitz R. B., Chuong C. M. Regenerative hair waves in aging mice and extra-follicular modulators follistatin, dkk1, and sfrp4. The Journal of Investigative dermatology. 2014;134(8):2086–2096. DOI: 10.1038/jid.2014.139.

10. Kreienkamp R., Gonzalo S. Metabolic Dysfunction in Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome. Cells. 2020;9(2):395. DOI: 10.3390/cells9020395.

11. Sakamoto M., Nakano T., Tsuge I., Yamanaka H., Katayama Y., Shimizu Y., Note Y., Inoie M., Morimoto N. Dried human cultured epidermis accelerates wound healing in diabetic mouse skin defect wounds. Scientific Reports. 2022;12(1):3184. DOI: 10.1038/s41598-022-07156-w.

12. Rahul V. G., Ellur G., Gaber A. A., Govindappa P. K., Elfar J. C. 4-aminopyridine attenuates inflammation and apoptosis and increases angiogenesis to promote skin regeneration following a burn injury in mice. Cell Death Discovery. 2024;10(1):428. DOI: 10.1038/s41420-024-02199-6.

13. Семивеличенко Е. Д., Ермолаева А. А., Пономаренко В. В., Новоселов А. В., Плиско Г. А., Ивкин Д. Ю., Антонов В. Г., Карев В. Е., Титович И. А., Ерёмин А. В. Исследование эффективности действия препаратов на основе молекулярных комплексов аденозин-полимер на модели термического ожога. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2022;11(3):209–219. DOI: 10.33380/2305-2066-2022-11-3-209-219.

14. Voisey J., van Daal A. Agouti: from mouse to man, from skin to fat. Pigment Cell Research. 2002;15(1):10–18. DOI: 10.1034/j.1600-0749.2002.00039.x.

15. Cropley J. E., Suter C. M., Beckman K. B., Martin D. I. K. Germ-line epigenetic modification of the murine Avy allele by nutritional supplementation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006;103(46):17308–17312. DOI: 10.1073/pnas.0607090103.

16. Ounpraseuth S., Rafferty T. M., McDonald-Phillips R. E., Gammill W. M., Siegel E. R., Wheeler K. L., Nilsson E. A., Cooney C. A. A method to quantify mouse coat-color proportions. PLoS ONE. 2009;4(4):e5414. DOI: 10.1371/journal.pone.0005414.

17. Lavado A., Olivares C., García-Borrón J. C., Montoliu L. Molecular basis of the extreme dilution mottled mouse mutation: a combination of coding and noncoding genomic alterations. The Journal of Biological Chemistry. 2005;280(6):4817–4824. DOI: 10.1074/jbc.M410399200.

18. Weller H. I., Hiller A. E., Lord N. P., Van Belleghem S. M. recolorize: An R package for flexible colour segmentation of biological images. Ecology Letters. 2024;27(2):e14378. DOI: 10.1111/ele.14378.

19. Ногаева У. В., Ивкин Д. Ю., Плиско Г. А., Флисюк Е. В., Ковансков В. Е., Штырлин Ю. Г., Сидоров К. О. Сравнительная эффективность трансдермальных форм для терапии алопеции. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021;10(4):171–178. DOI: 10.33380/2305-2066-2021-10-4(1)-171-178.

20. Wickham H., Averick M., Bryan J., Chang W., McGowan L. D., François R., Grolemund G., Hayes A., Henry L., Hester J., Kuhn M., Pedersen T. L., Miller E., Bache S. M., Müller K., Ooms J., Robinson D., Seidel D. P., Spinu V., Takahashi K., Vaughan D., Wilke C., Woo K., Yutani H. Welcome to the tidyverse. Journal of Open Source Software. 2019;4(43):1686. DOI: 10.21105/joss.01686.

21. Badano A., Revie C., Casertano A., Cheng W. C., Green P., Kimpe T., Krupinski E., Sisson C., Skrøvseth S., Treanor D., Boynton P., Clunie D., Flynn M. J., Heki T., Hewitt S., Homma H., Masia A., Matsui T., Nagy B., Nishibori M., Penczek J., Schopf T., Yagi Y., Yokoi H, Summit on Color in Medical Imaging. Consistency and standardization of color in medical imaging: a consensus report. Journal of Digital Imaging. 2015;28(1):41–52. DOI: 10.1007/s10278-014-9721-0.

22. Савельев Д. С., Городков С. Ю., Горемыкин И. В. Стандартизация колориметрии медицинской фотографии в клинической практике. Детская хирургия. 2024;28(5):460– 471. DOI: 10.17816/ps803.

23. Bonetto A., Andersson D. C., Waning D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. BoneKEy Reports. 2015;4:732. DOI: 10.1038/bonekey.2015.101.