Разработка, валидация и апробация биоаналитической методики определения этмабена в плазме крови и органах крыс методом ВЭЖХ-УФ

Введение. Ввиду сохраняющейся тенденции роста количества пациентов с сердечно-сосудистыми патологиями и уровня летальности в данной нозологической группе актуальным направлением R&D-исследований является поиск и фармацевтическая разработка инновационных кардиотропных препаратов. Одним из таких препаратов является производное малоновой кислоты – этмабен, синтезированный в Санкт-Петербургском государственном химико-фармацевтическом университете (СПХФУ). Для проведения доклинических исследований необходимо наличие валидной биоаналитической методики, позволяющей с минимальными временными и ресурсными затратами количественно определять этмабен в сложных биологических матрицах.

Цель. Целью исследования является разработка и валидация методики определения этмабена в плазме крови и органах лабораторных крыс методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием (ВЭЖХ-УФ) с последующей апробацией и получением пула данных о распределении этмабена в органах и тканях экспериментальных животных.

Материалы и методы. Разработку и валидацию биоаналитической методики, а также определение количественного содержания этмабена проводили на жидкостном хроматографе Flexar (PerkinElmer, США), снабженном УФ-детектором и термостатируемым автодозатором, с использованием колонки Kromasil 100, 150 × 2,1, C8, 3,5 мкм (AkzoNobel, Нидерданды). Детектирование проводили при длине волны 270 нм. Фармакологический эксперимент для целей апробации методики проводили на 20 беспородных крысах-самцах (НИЦ «Курчатовский институт» – ПИЯФ – ПЛЖ «Рапполово», Россия), разделенных на группу контроля (интактные животные, n = 10) и группу экспериментальной хронической сердечной недостаточности (ХСН) (n = 10), модель которой индуцировали перевязкой левой коронарной артерии. Все животные в течение 30 дней получали этмабен внутрижелудочно в дозе 60 мг/кг. Для анализа на 30-е сутки у животных отбирали образцы цельной крови и изолировали органы (сердце, почки). В плазме крови и гомогенатах тканей проводили количественное определение этмабена методом ВЭЖХ-УФ после пробоподготовки, включающей осаждение белков ацетонитрилом (ос.ч., кат. № A/0626/17, Thermo Fisher Scientific, США).

Результаты и обсуждение. Разработаны оптимальные условия хроматографического определения этмабена в биологических матрицах (плазма крови и гомогенаты тканей) методом ВЭЖХ-УФ. Валидация разработанной методики проводилась по следующим валидационным параметрам: селективности, градуировочной кривой, правильности, прецизионности, нижнему пределу количественного определения (НПКО), эффекту переноса, отсутствию влияния разбавления образца, стабильности. Также оценивали степень извлечения этмабена из матрицы. НПКО этмабена составил 5,0 нг/мл. Разработанная методика была успешно применена для оценки распределения этмабена в органах и тканях лабораторных животных на отдельных этапах доклинического исследования. При ХСН концентрация этмабена в плазме крови возрастает в 2 раза, а в патологически измененном миокарде – на 47 % по сравнению с животными контрольной группы, при этом в тканях почки препарат не детектировался.

Заключение. Разработана и валидирована биоаналитическая методика определения этмабена методом ВЭЖХ-УФ, которая была апробирована на этапе доклинических испытаний препарата для изучения распределения в органах и тканях экспериментальных животных. Выявленное избирательное накопление этмабена в поврежденном миокарде подтверждает его терапевтическую релевантность для лечения ХСН.

1. Концевая А. В., Муканеева Д. К., Игнатьева В. И., Анциферова А. А., Драпкина О. М. Экономика профилактики сердечно-сосудистых заболеваний в Российской Федерации. Российский кардиологический журнал. 2023;28(9):5521. DOI: 10.15829/1560-4071-2023-5521.

2. Семенов В. Ю., Самородская И. В. Динамика мужской и женской смертности от болезней системы кровообращения в Российской Федерации (2013–2022гг.). Российский кардиологический журнал. 2025;30(5):6086. DOI: 10.15829/1560-4071-2025-6086.

3. Галявич А. С., Терещенко С. Н., Ускач Т. М., Агеев Ф. Т., Аронов Д. М., Арутюнов Г. П., Беграмбекова Ю. Л., Беленков Ю. Н., Бойцов С. А., Бубнова М. Г., Васюк Ю. А., Виллевальде С. В., Виноградова Н. Г., Гарганеева A. А., Гендлин Г. Е., Гиляревский С. Р., Глезер М. Г., Готье С. В., Гринштейн Ю. И., Довженко Т. В., Драпкина О. М., Дупляков Д. В., Жиров И. В., Затейщиков Д. А., Звартау Н. Э., Иртюга О. Б., Кобалава Ж. Д., Козиолова Н. А., Коротеев А. В., Либис Р. А., Лопатин Ю. М., Мареев В. Ю., Мареев Ю. В., Мацкеплишвили С. Т., Михайлов Е. Н., Насонова С. Н., Нарусов О. Ю., Недогода С. В., Недошивин А. О., Овчинников А. Г., Орлова Я. А., Перепеч Н. Б., Погосова Н. В., Римская Е. М., Самко А. Н., Саидова М. А., Сапельников О. В., Сафиуллина А. А., Ситникова М. Ю., Скворцов А. А., Скибицкий В. В., Стукалова О. В., Тарловская Е. И., Терещенко А. С., Чесникова А. И., Федотов П. А., Фомин И. В., Хасанов Н. Р., Шевченко А. О., Шапошник И. И., Шария М. А., Шляхто Е. В., Явелов И. С., Якушин С. С. Хроническая сердечная недостаточность. Клинические рекомендации 2024. Российский кардиологический журнал. 2024;29(11):6162. DOI: 10.15829/1560-4071-2024-6162.

4. Ивкин Д. Ю., Карпов А. А., Драчева А. В., Питухина Н. Н., Ивкина А. С., Бурякина А. В., Теслев. А. А. Влияние производного бензойной кислоты на формирование экспериментальной хронической сердечной недостаточности. Фармация. 2016;63(4):49–52.

5. Abe J., Vujic A., Prag H. A., Murphy M. P., Krieg T. Malonate given at reperfusion prevents post-myocardial infarction heart failure by decreasing ischemia/reperfusion injury. Basic Research in Cardiology. 2024;119(4):691–697. DOI: 10.1007/s00395-024-01063-z.

6. Gundogdu G., Senol O., Demirkaya Miloglu F., Koza Y., Gundogdu F., Hacımüftüoğlu A., Abd El-Aty A. M. Serum metabolite profiling of ST-segment elevation myocardial infarction using liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Biomedical Chromatography. 2020;34(2):e4738. DOI: 10.1002/bmc.4738.

7. Ambati C. S. R., Yuan F., Abu-Elheiga L. A., Zhang Y., Shetty V. Identification and Quantitation of Malonic Acid Biomarkers of In-Born Error Metabolism by Targeted Metabolomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2017;28(5):929–938. DOI: 10.1007/s13361-017-1631-1.

8. Гришина А. Ю., Карпов А. А. Изучение фармакокинетических параметров – 4-((3-оксо-3-этоксипропаноил) амино)бензойной кислоты (этмабена). От молекулы до лекарственного препарата. В сб.: I Всероссийская научная конференция. 27 октября 2023 года. Санкт-Петербург: Изд-во СПХФУ; 2023. C. 58–61.

9. Карнакова П. К., Комаров Т. Н., Арчакова О. А., Ивкин Д. Ю., Ветрова Е. С., Тернинко И. И., Шохин И. Е., Наркевич И. А. Разработка и валидация методики количественного определения этмабена в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2024;13(1):257–271. DOI: 10.33380/2305-2066-2024-13-1-1752.

10. Карнакова П. К., Карнакова К. К., Комаров Т. Н., Багаева Н. С., Попова М. О., Ивкин Д. Ю., Арчакова О. А., Шохин И. Е., Наркевич И. А. Изучение фармакокинетики производного малоновой кислоты этмабена в рамках I фазы клинического исследования. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2024;13(4):259–271. DOI: 10.33380/2305-2066-2024-13-4-1965.

11. Ивкин Д. Ю., Зеленцова А. Б., Краснова М. В., Карпов А. А., Пажельцев В. В., Напалкова С. М., Тернинко И. И., Титович И. А., Оковитый С. В. Сравнительная эффективность фармакотерапии хронической сердечной недостаточности в эксперименте. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2025;14(1):349–357. DOI: 10.33380/2305-2066-2025-14-1-1998.

12. Shang H., Dai X., Li M., Kai Y., Liu Z., Wang M., Li Q., Gu Y., Liu C., Si D. Absolute bioavailability, dose proportionality, and tissue distribution of rotundic acid in rats based on validated LC-QqQ-MS/MS method. Journal of Pharmaceutical Analysis. 2022;12(2):278–286. DOI: 10.1016/j.jpha.2021.03.008.

13. Putriana N. A., Rusdiana T., Puspitadewi N., Rahayu D., Saputri F. A. Validation of bioanalytical method for quantification of Vitamin K2 (MK-4) in human plasma by high-performance liquid chromatography-ultraviolet. Journal of Advanced Pharmaceutical Technology & Research. 2023;14(4):345–350. DOI: 10.4103/JAPTR.JAPTR_139_23.

14. Choi H.-I., Jeong H.-C., Jeong J.-W., Lee J., Kim D. H., Ko K.-C., Chae Y.-J., Lee K.-R. Development and validation of an LC-MS/MS method for Tirzepatide, a dual GIP/GLP-1 receptor agonist, in rat plasma for application to a pharmacokinetic study. Journal of Chromatography B. 2026;1268:124836. DOI: 10.1016/j.jchromb.2025.124836.

15. Юсковец В. Н., Яковлев И. П., Наркевич И. А. Способ получения 4-[(3-этокси-3-оксопропаноил)амино]бензойной кислоты. Патент РФ на изобретение № 2515245 C1 от 07.02.2013. Доступно по: https://patents.google.com/patent/RU2515245C1/ru Ссылка активна на 10.03.2026.

16. Адамова А. А. Количественное определение стандартного образца 4-((3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойнойкислоты (этмабена) методом материального баланса. В сб.: XIII Всероссийская научная конференция школьников, студентов и аспирантов с международным участием. Молодая фармация – потенциал будущего. 01–11 марта 2023 года. Санкт-Петербург: Изд-во СПХФУ; 2023. C. 163–166.

17. Генералова Ю. Э., Тернинко И. И., Зеленцова А. Б. Сквозная стандартизация оригинальных лекарственных средств при определении родственных примесей. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2023;12(4):209–216. DOI: 10.33380/2305-2066-2023-12-4-1573.

18. Алексеева Г. М., Апраксин В. Ф., Генералова Ю. Э. Изучение кислотно-основных свойств, разработка и валидация методики количественного определения оригинальной фармацевтической субстанции. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2019;8(1):66–71. DOI: 10.33380/2305-2066-2019-8-1-66-71.