Разработка и изучение нового анти-HER2 терапевтического конъюгата на основе DARPin G3

Введение. Сверхэкспрессия рецептора эпидермального фактора роста 2-го типа (HER2) является значимым фактором агрессивного течения ряда злокачественных новообразований и определяет необходимость разработки новых эффективных подходов к проведению таргетной терапии. Одним из перспективных направлений являются конъюгаты «белок – лекарственное средство», обеспечивающие селективную доставку цитотоксических агентов в опухолевые клетки. В качестве альтернативы моноклональным антителам рассматриваются каркасные белки на основе анкириновых повторов (DARPin), отличающиеся высокой аффинностью, стабильностью и возможностью наработки в прокариотических системах. Однако стандартизация и аналитический контроль таких конъюгатов требуют разработки специализированных и валидированных методик.

Цель. Разработка терапевтического конъюгата на основе DARPin G3 и цитотоксического агента эмтанзина, а также создание адаптированных методик его стандартизации в форме активной фармацевтической субстанции.

Материалы и методы. Объектом исследования являлся терапевтический конъюгат DARPin G3-ABD, специфичный к HER2, ковалентно связанный с эмтанзином через малеимидный линкер. Получение включало восстановление белка, конъюгацию и очистку методом эксклюзионной хроматографии. Для характеристики использовали методы УФ-спектрофотометрии, колориметрический анализ с бицинхониновой кислотой (BCA), нано-ВЭЖХ-МС/МС и электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Биологическую активность оценивали по выживаемости клеток аденокарциномы молочной железы линии SKBR3 с гиперэкспрессией HER2 в МТТ-тесте. Валидацию аналитической методики проводили в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации.

Результаты и обсуждение. Проведена комплексная характеристика белкового терапевтического конъюгата по показателям подлинности, содержания родственных примесей, количественного содержания и биологической активности. Подлинность конъюгата подтверждена методом ВЭЖХ-МС/МС, обеспечившим 100 % перекрытие аминокислотной последовательности. Электрофорез в ПААГ серий конъюгата продемонстрировал наличие одной основной полосы, подтверждая высокую чистоту и монодисперсность образцов при содержании димерной фракции менее 6 %. Количественное определение конъюгата G3-ABD-DM1 выполняли методами прямой УФ-спектрофотометрии при длине волны 252 нм и колориметрии с бицинхониновой кислотой. Валидация УФ-спектрофотометрической методики подтвердила ее специфичность, линейность (R = 0,999), отсутствие систематической погрешности и высокую прецизионность (RSD не более 2,06 %). Напротив, метод BCA характеризовался статистически значимой систематической погрешностью (δ = 2,76 %), что обосновывает преимущество УФ-спектрофотометрии для стандартизации субстанции. Конъюгат проявил выраженную дозозависимую цитотоксичность в отношении HER2-положительных клеток со значением IC₅₀ = 40 ± 10 нМ, тогда как отрицательный контроль без цитотоксического агента не влиял на жизнеспособность опухолевых клеток.

Заключение. Разработан и охарактеризован таргетный конъюгат на основе DARPin G3-ABD и эмтанзина, обладающий высокой чистотой, подтвержденной первичной структурой и специфической цитотоксической активностью в отношении HER2-экспрессирующих клеток. Предложен комплекс аналитических методик (УФ-спектрофотометрия, ВЭЖХ-МС/МС, SDS-PAGE), обеспечивающий надежный контроль качества конъюгата как активной фармацевтической субстанции для последующих доклинических исследований.

1. Tuefferd M., Couturier J., Penault-Llorca F., Vincent-Salomon A., Broet P., Guastalla J.-P., Allouache D., Combe M., Weber B., Pujade-Lauraine E. HER2 status in ovarian carcinomas: a multicenter GINECO study of 320 patients. PLoS ONE. 2007;2(11):e1138. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001138

2. Høgdall E. V. S., Christensen L., Kjaer S. K., Blaakaer J., Bock J. E., Glud E., Nørgaard-Pedersen B., Høgdall C. K. Distribution of HER-2 overexpression in ovarian carcinoma tissue and its prognostic value in patients with ovarian carcinoma: from the Danish “MALOVA” ovarian cancer study. Cancer. 2003;98(1):66–73. https://doi.org/10.1002/cncr.11476

3. Ballantyne A., Dhillon S. Trastuzumab emtansine: first global approval. Drugs. 2013;73(7):755–765. https://doi.org/10.1007/s40265-013-0050-2

4. Gauzy-Lazo L., Sassoon I., Brun M.-P. Advances in antibody–drug conjugate design: current clinical landscape and future innovations. SLAS Discovery. 2020;25(8):843–868. https://doi.org/10.1177/2472555220912955

5. Larkina M., Varvashenya R., Prach A., Plotnikov E., Tretyakova M., Eskova D., Bodenko V., Yanovich G., Schulga A., Konovalova E., Ziganshin R., Belousov M., Chernov V., Tolmachev V., Deyev S. The position of ^99mTc-HYNIC and the molecular design of the DARPin G3 constructs influence the selection of an imaging tracer to detect expression in HER2-expressing tumors. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2026;335:1945–1959. https://doi.org/10.1007/s10967-026-10739-w

6. Zelchan R., Chernov V., Medvedeva A., Rybina A., Bragina O., Mishina E., Larkina M., Varvashenya R., Fominykh A., Schulga A., Konovalova E., Vorobyeva A., Orlova A., Tashireva L., Deyev S. M., Tolmachev V. Phase I clinical evaluation of designed ankyrin repeat protein [^99mTc]Tc(CO)₃-(HE)₃-Ec1 for visualization of EpCAM-expressing lung cancer. Cancers. 2024;16(16):2815. https://doi.org/10.3390/cancers16162815

7. Варвашеня Р. Н., Прач А. А., Плотников Е. В., Деев С. М., Белоусов М. В., Ларькина М. С., Чернов В. И. Оценка функциональной пригодности лиофилизата таргетных каркасных белков с анкириновыми повторами для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2/neu в злокачественных опухолях. Бюллетень сибирской медицины. 2024;23(3):16–24. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2024-3-16-24

8. Deyev S. M., Oroujeni M., Garousi J., Gräslund T., Li R., Rosly A. H. B., Orlova A., Konovalova E., Schulga A., Vorobyeva A., Tolmachev V. Preclinical evaluation of HER2-targeting DARPin G3: impact of albumin-binding domain (ABD) fusion. International Journal of Molecular Sciences. 2024;25(8):4246. https://doi.org/10.3390/ijms25084246

9. Wakankar A., Chen Y., Gokarn Y., Jacobson F. S. Analytical methods for physicochemical characterization of antibody drug conjugates. mAbs. 2011;3(2):161–172. https://doi.org/10.4161/mabs.3.2.14960

10. Li M., Zhao X., Yu C., Wang L. Antibody-drug conjugate overview: a state-of-the-art manufacturing process and control strategy. Pharmaceutical Research. 2024;41(3):419–440. https://doi.org/10.1007/s11095-023-03649-z

11. Прач А. А., Ларькина М. С., Кривощеков С. В., Белоусов М. В., Плотников Е. В. Оценка возможности использования метода УФ-спектрофотометрии для стандартизации нового таргетного конъюгата на основе рекомбинантного слитого белка и эмтанзина. Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2026;(1):97–104.

12. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0

13. Rogatsky E. Pandora box of BCA assay. Investigation of the accuracy and linearity of the microplate bicinchoninic protein assay: Analytical challenges and method modifications to minimize systematic errors. Analytical Biochemistry. 2021;631:114321. https://doi.org/10.1016/j.ab.2021.114321