Ингибирование фермента дипептидилпептидазы-4 после перорального введения кроликам экстракта гонад морских ежей (Strongylocentrotus droebahiensis) как возможный биомаркер фармакокинетики

Введение. Оценка фармакокинетического профиля действующих веществ является необходимым этапом разработки лекарственного препарата. Исследованный в работе экстракт представляет собой комплекс биологически активных соединений, выделенных из гонад морских ежей Strongylocentrotus droebachiensis Баренцева моря, содержащий в своем составе пептидные соединения, жирные кислоты, каротиноиды и токоферолы. Выявлена ингибирующая активность экстракта гонад морских ежей в отношении фермента дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4). Традиционные подходы к изучению фармакокинетики, основанные на применении хроматографических методов, зачастую не являются эффективными для таких комплексных объектов; альтернативой могут служить методы иммуноферментного анализа.

Цель. Цель исследования - поиск подходов к изучению фармакокинетики экстракта гонад морских ежей на кроликах после его перорального введения в трех дозах.

Материалы и методы. Для характеристики химического состава образцов экстракта гонад морских ежей и определения содержания возможных целевых аналитов в биопробах использованы спектрофотометрические и хроматографические (ВЭЖХ и ТСХ) методы. Изучение фармакокинетики проводили на самцах кроликов после однократного перорального введения экстракта гонад морских ежей. Была установлена корреляция между его концентрацией в плазме крови и биологической активностью, в качестве маркера которой использована активность фермента ДПП-4. Активность фермента определяли хромогенным оптическим методом.

Результаты и обсуждение. Охарактеризованы основные группы биологически активных веществ в составе экстракта гонад морских ежей. Содержание пептидов составило 15-22 %, содержание а-токоферола - 0,05-0,15 %, суммарное содержание токоферолов - 0,23-0,38 %, содержание каротиноидов - 0,005-0,07 %, содержание суммы жирных кислот в пересчете на линоленовую кислоту - 11,03-12,74 %. В связи с низким содержанием биологически активных веществ различных классов и отсутствием доминирующих компонентов оптимальным для изучения фармакокинетики признан подход, базирующийся на корреляции между активностью специфического маркера (активность фермента ДПП-4) и концентрацией экстракта в плазме крови. Разработана методика количественного определения экстракта гонад морских ежей в плазме крови кроликов по активности фермента ДПП-4. Методика валидирована по параметрам: селективность, нижний предел количественного определения, диапазон линейности, точность, прецизионность. Изучена фармакокинетика экстракта гонад морских ежей в плазме крови после перорального введения кроликам в диапазоне доз 5-25 мг/кг. Средняя максимальная концентрация (C_max) в зависимости от дозы была 37-115 мкг/мл, площадь под фармакокинетической кривой (AUC_0-24) - 193-594 ч • мкг/мл, время достижения максимальной концентрации (T_max) составило 3-3,5 ч, период полувыведения (Т_1/2) - 7,9-9,9 ч, среднее время удержания (MRT) - 11-14 ч.

Заключение. С помощью нетрадиционного подхода, основанного на корреляции активности специфического маркера (ДПП-4) и концентрации препарата, охарактеризована фармакокинетика экстракта гонад морских ежей после однократного перорального введения кроликам. Схожие подходы могут быть эффективны для многокомпонентных природных смесей, которые затруднительно или невозможно анализировать на основе традиционных хроматографических (ВЭЖХ-УФ/ФЛ/МС, ГХ-МС и др.) методов.

1. Pozharitskaya O. N., Shikov A. N., Laakso I., Sappanen-Laakso T., Makarenko I. E., Faustova N. M., Makarova M. N., Makarov V. G. Bioactivity and chemical characterization of gonads of green sea urchin Strongylocentrotus droebahensis from Barents Sea. J. of funct. Foods. 2015;17:227-234.

2. Mentlein R. Dipeptidyl-peptidase IV (CD26) - role in the inactivation of regulatory peptides. Regulatory peptides. 1999;85(1):9-24.

3. Косман В. М., Фаустова Н. М., Пожарицкая О. Н., Макаров В. Г. Разработка, валидация и применение методики иммуноферментного анализа для стандартизации биопрепарата. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2015;2(11):176-182.

4. Карлина М. В., Фаустова Н. М., Пожарицкая О. Н., Косман В. М., Шиков А. Н., Макаров В. Г. Определение дарбэпоэтина альфа в плазме крови кроликов методом иммуноферментного анализа. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2016;4(17):204-210.

5. Митюшова Е. В., Фаустова Н. М., Пожарицкая О. Н., Макаров В. Г., Шиков А. Н. Разработка и валидация методики определения иммуногенности препарата интерферона альфа-2а. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2017;1:194-200.

6. Pozharitskaya O. N., Shikov A. N., Faustova N. M., Obluchinskaya E. D., Kosman V. М., Vuorela H., Makarov V. G. Pharmacokinetic and tissue distribution of fucoidan from Fucus vesiculosus after oral administration to rats. Marine Drugs. 2018;16(4):132-142.

7. Shikov A. N., Pozharitskaya O. N., Faustova N. M., Kosman V. M., Razzazi-Fazeli E., Novak J. Pharmacokinetic Study of Bioactive Glycopeptide from Strongylocentrotus droebachiensis after Intranasal Administration to Rats Using Biomarker Approach. Marine Drugs. 2019;17:577-590.

8. Guidance for Industry. Exposure-Response Relationships - Study Design, Data Analysis, and Regulatory. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). 2003.

9. Guideline on non-clinical and clinical development of similar biological medicinal products containing low-molecular-weight-heparins. EMEA/CHMP/BMWP/118264/2007 Rev.1. 2017. 8 р.

10. Правила проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза. 2016. 716 с.

11. Пожарицкая О. Н., Уракова И. Н., Шиков А. Н., Макаров В. Г. Способ комплексной переработки морских ежей. Патент RU 2 432 956 С1, приоритет от 08.07.2010, опубликовано 10.11.2011. Бюл. № 31.

12. Dawson R. M. C., Elliott D. C., Elliott W. Y., Jones R. M. Data for biochemical research. (third edition). Oxford Science Publications, OUP, Oxford, 1986. 580 p.

13. Косман В. М., Фаустова Н. М., Зенкевич И. Г., Пожарицкая О. Н., Шиков А. Н., Макаров В. Г. Сравнительная характеристика состава образцов масла зародышей пшеницы различного происхождения. Масложировая промышленность. 2007;6:32-34.

14. Sherma J., Fried B. Thin Layer Chromatographic Analysis of biological Samples. A review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2005;28:2297-2314.

15. Миронов А. Н. и др., ред. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. М.: Гриф и К, 2013. С. 6-44.

16. Миронова А. Н., ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012. C. 845-855.

17. Bland M. An Introduction to Medical Statistics (3^rdedition). Oxford Medical Publications, 2000. 422 р.

18. Dipeptidyl peptidase IV. Enzymatic assay. Available at: http://www. sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/cell-signaling-enzymes/dipeptidyl-peptidase-iv.html (accessed 02.04.2020).

19. Lin Lu. I., Tsai K.-C., Chiang Y.-K. et al. A three-dimensional pharmacophore model for dipeptidyl peptidase IV inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry. 2008;43(8):1603-1611.

20. Пиотровский В. К. Метод статистических моментов и интегральные модельно-независимые параметры фармакокинетики. Фармакология и токсикология. 1986;49(5):118-127.

21. Ruperez F. J., Martin D., Herera E., Barbas C. Chromatographic analysis of tocopherol and related compounds in various matrices. J. of Chromatogr. 2001;935(1-2):45-69.

22. Agatsuma Y., Sato M., Taniguchi K. Factor Causing Brown-Colored Gonads of The Sea Urchine, Strongylocentrotus nudus, in Northern Honshu, Japan. Aquaculture. 2005;249:449-458.

23. Kosman V. M., Faustova N. M., Pozharitskaya O. N., Shikov A. N. Various approaches to pharmacokinetic study of Adelandak -Strongylocentrotus droebachiensis gonads extract. Abstracts book of 22-d Int. Congress «Phytopharm 2018», Horgen, Switzerland, 2018. P. 59-60.

24. Guideline on bioanalytical method validation. EMEA/CHMP/ EWP192217/2009, London, Committee for medicinal products for human use (CHMP), 2011.

25. ICH, Q2A, Harmonized tripartite guideline, text on validation of analytical procedures, IFPMA. In: Proceedings of the International Conference on Harmonization, Geneva, March 1994. Р. 1-5.

26. ICH, Q2B, Harmonized tripartite guideline, validation of analytical procedure: methodology, IFPMA. In: Proceedings of the International Conference on Harmonization, Geneva, March 1996. Р. 1-8.

27. Guidance for Industry: Bioanalytical method for validation. Rockville, MD, U.S. Department of Health and Human Services, FDA, Center for Drug Evaluation and Research, Center for veterinary medicine, 2001.

28. Su H., Zhang Y., Huang W., Wen L., Zhuang Z., Chen G. Pharmacokinetic and tissue distribution of oleic and linoleic acids following oral and rectal administration of Brucea javanica oil in rats. Int. j. of Pharmacology. 2016;12(5):461-482.

29. Tamaro J., Tamaro M. Pharmacokinetics and safety profile of omega-3 polyunsaturated fatty acids. In: Omega-3 Fatty Acids. Switzerland, Springer Publisher, 2016. P. 541-584.

30. Braeckman R. A., Stirtan W. G., Soni P. N. Pharmacokinetics of eicosapentaenoic acid in plasma and red blood cells after multiple oral dosing with Icosapent Ethyl in healthy subjects. Clinical Pharmacology in Drug Development. 2013;3(2):101-108

31. Petyaev I. M., Chalyk N. E., Klochkov V. A., Pristensky D. V., Chernyshova M. P., Kyle N. H., Bashmakov Y. K. Pharmacokinetics and oxidation parameters in volunteers supplemented with microencapsulated docosahexaenoic acid. Int. j. of Applied Basic Medical research. 2018;8(3):148-154.