Разработка методики одновременного определения прегнанового стероида с гестагенной активностью гестобутаноила и двух его метаболитов в сыворотке крови крыс

Введение. Гестобутаноил – синтетический прегнановый стероид с гестагенной активностью имеет два метаболита (АМОЛ и мегестрола ацетат), обладающих собственной фармакологической активностью. Из этого следует необходимость детального изучения кинетики метаболитов. Рационально объединить исследование фармакокинетики гестобутаноила и его метаболитов: АМОЛа и мегестрола ацетата. Одновременное определение нескольких аналитов в сыворотке крови экспериментальных животных (крыс) возможно осуществить при помощи современных аналитических методов хромато-масс-спектрометрии.
Цель. Разработать аналитическую методику одновременного определения гестобутаноила и двух его метаболитов в биологической матрице (сыворотке крови крыс).
Материалы и методы. Для определения гестобутаноила и двух его метаболитов в биологической матрице использовали следующие методы: ГХ-МС, ВЭЖХ-ESI-МС, ВЭЖХ-ESI-МС с дериватизацией аналитов, ВЭЖХ-APCI-МС.
Результаты и обсуждение. При работе с ГХ-МС хроматографические пики гестобутаноила, АМОЛа и мегестрола ацетата сильно размывались и накладывались друг на друга, что, по-видимому, обусловлено термолабильностью веществ. От метода ГХ-МС отказались в пользу ВЭЖХ. Аналиты разделялись при помощи ВЭЖХ в градиентном режиме элюирования на колонке С18. Ионизация ESI не давала типичных протонированных ионов гестобутаноила и АМОЛа, а интенсивные сигналы их катионизированных ионов и ионов-фрагментов, которые наблюдались в спектрах АМОЛа и гестобутаноила, не могли обеспечить воспроизводимость спектров, поскольку условия их образования не подходят для рутинного анализа. Дериватизация аналитов с образованием оксимов и замещенных гидразонов не давала ожидаемых продуктов реакции для работы в ВЭЖХ-ESI-МС. APCI позволила убрать интенсивные катионизированные ионы из спектров гестобутаноила и АМОЛа и увеличить надежность метода. Методика ВЭЖХ-APCI-МС воспроизвелась на модельной сыворотке крови крыс.
Заключение. Разработана ВЭЖХ-МС-методика одновременного определения гестобутаноила, мегестрола ацетата и АМОЛа. Методика апробирована на модельной сыворотке крови крыс, содержащей все три аналита.

1. Fülöp I., Vari C.-E., Miklos A., Imre S. LC-MS/MS ESI methods for the determination of oestrogens and androgens in biological matrix – a minireview. Farmacia. 2017;65(4):485–493.

2. Liu Q., Chi Q., Fan R.-T., Tian H.-D., Wang X. Quantitative-Profiling Method of Serum Steroid Hormones by Hydroxylamine-Derivatization HPLC–MS. Natural Products and Bioprospecting. 2019;9:201–208.

3. Shackleton C. Clinical steroid mass spectrometry: a 45-year history culminating in HPLC-MS/MS becoming an essential tool for patient diagnosis. J Steroid Biochem Mol Biol. 2010;121(3–5):481–490. DOI: 10.1016/j.jsbmb.2010.02.017.

4. Taylor A. E., Keevil B., Huhtaniemi I. T. Mass spectrometry and immunoassay: how to measure steroid hormones today and tomorrow. Eur J Endocrinol. 2015;173(2):D1–12. DOI: 10.1530/EJE-15-0338.

5. Sheina N. I., Parshin V. A., Kolesnikova V. V., Myalina L. I., Sazonova L. P., Fedotcheva T. A., Shimanovskii N. L. Generative function of female rats upon intragastric administration of tablets of the new steroid drug gestobutanoil. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2020;54:439–443. DOI: 10.1007/s11094-020-02219-6.

6. Zeinalov O. A., Yaderets V. V., Stytsenko T. S., Petrosyan M. A., Andryushina V. A. Synthesis and biological activity of synthetic 17α-hydroxyprogesterone derivatives. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2012;46: 203–206.

7. Stepanova E. S., Makarenkova L. M., Chistyakov V. V., Rybakov Y. L., Gukasov V. M., Fedotcheva T. A., Parshin V. A., Votyakov V. A., Shimanovskii N. L. HPLC-MS method for simultaneous quantitative determination of an innovative russian gestagen and its metabolites in rat and rabbit blood sera. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2019;52(12):1016–1020. DOI: 10.1007/s11094-019-01944-x.

8. Stepanova E. S., Makarenkova L. M., Chistyakov V. V., Fedotcheva T. A., Parshin V. A., Shimanovsky N. L. Metabolism of Gestobutanoil, a Novel Drug of Progestin Group. Sovremennye tehnologii v medicine. 2019;11(3):48–53. DOI: 10.17691/stm2019.11.3.06.

9. Семейкин А. В., Федотчева Т. А., Свешникова Е. Д., Шилов Б. В., Смирнов А. С., Шимановский Н. Л. Цитостатическая активность и энергия лиганд-рецепторного взаимодействия нового отечественного гестагена гестобутаноила и его метаболитов. Химико-фармацевтический журнал. 2020;54(11):3–8.

10. Schindler A. E., Campagnoli C., Druckmann R., Huber J., Pasqualini J. R., Schweppe K. W., Thijssen J. H. Н. Classification and pharmacology of progestins. Maturitas. 2008;61(1–2):171-80. DOI: 10.1016/j.maturitas.2008.11.013.