Кросс-валидация методик количественного определения феназепама и его активного метаболита в плазме крови человека при различной экстракции

Введение. При проведении терапевтического лекарственного мониторинга (ТЛМ) часто возникает ситуация, когда концентрацию лекарственного средства измеряют разными методами или в разных лабораториях. Для объединения и анализа данных, полученных с помощью разных методов, необходимо выполнять перекрестную валидацию (кросс-валидацию). Применяемым для этого статистическим подходам уделяется недостаточное внимание.

Цель. Выполнить кросс-валидацию разных методик количественного определения феназепама (ФЕН) и 3-гидроксифеназепама (3-ОН-ФЕН) с помощью анализа Бленда – Альтмана.

Материалы и методы. Концентрации ФЕН и 3-ОН-ФЕН в плазме крови пациентов (n = 100) c синдромом отмены алкоголя были измерены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС). В каждом образце содержание обоих аналитов измеряли двукратно с помощью двух разных методик: твердофазной экстракции (SPE, от англ. «solid phase extraction») и жидкостной экстракции с поддержкой (SLE, от англ. «supported liquid extraction»). Обе методики до начала эксперимента прошли полную валидацию. Кросс-валидация проводилась по завершении эксперимента с использованием данных от испытуемых образцов. Для оценки правильности (accuracy) и прецизионности (precision) использовали анализ Бленда – Альтмана. Для выявления систематической ошибки между методиками также применяли регрессионный анализ Деминга.

Результаты и обсуждение. Для обоих аналитов были получены регрессионные зависимости между концентрациями, измеренными разными методами пробоподготовки. 95%-й доверительный интервал (ДИ) коэффициентов обоих уравнений включал единицу, а 95%-й ДИ свободного члена включал ноль. 95%-й ДИ геометрического среднего индивидуальных отношений SLE/SPE находился в пределах допустимого диапазона (0,87; 1,15). Данные результаты подтверждают отсутствие влияния количественной методики на измерение концентрации обоих аналитов. 66,7%-й ДИ относительной погрешности между двумя измерениями находился в допустимых пределах (–0,2; 0,2), не превышая 20%-й диапазон от их среднего значения. Это подтверждает приемлемую прецизионность между методиками. Вычисленные доверительные интервалы отражены на диаграммах аналитического смещения по Бленду – Альтману.

Заключение. Применяемые в работе статистические подходы подтвердили сопоставимость результатов разных методик пробоподготовки. Описанный в работе статистический алгоритм с применением диаграмм аналитического смещения по Бленду – Альтману, помимо кросс-валидации, может успешно применяться для оценки правильности и прецизионности при валидации и оценке приемлемости аналитического цикла, а также при повторном анализе испытуемых образцов.

1. Раменская Г. В., Шохин И. Е., Савченко А. Ю., Давыдова К. С., Кукес В. Г. Обзор требований к валидации биоаналитических методик. Ремедиум. 2011;12:60–63.

2. Эпштейн Н. А. Валидация аналитических методик: графические и расчетные критерии для оценки линейности методик на практике. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2019;8(2):122–130. DOI: 10.33380/2305-2066-2019-8-2-122-130.

3. Briggs R. J., Nicholson R., Vazvaei F., Busch J., Mabuchi M., Mahesh K. S., Brudny-Kloeppel M., Weng N., Galvinas P. A. R., Duchene P., Hu P., Abbott R. W. Method transfer, partial validation, and cross validation: recommendations for best practices and harmonization from the global bioanalysis consortium harmonization team. The AAPS Journal. 2014;16(6):1143–1148. DOI: 10.1208/s12248-014-9650-3.

4. Bioanalytical Method Validation. Guidance for Industry. FDA. Biopharmaceutics; 2018. 44 p.

5. Городничев А. В., Костюкова Е. Г. Место феназепама в современном применении бензодиазепиновых транквилизаторов. Современная Терапия Психических Расстройств. 2011;2:26–29.

6. Syrjanen R., Greene S. L., Weber C., Smith J. L., Hodgson S. E., Abouchedid R., Gerostamoulos D., Maplesden J., Knott J., Hollerer H., Rotella J.-A., Graudins A., Schumann J. L. Characteristics and time course of benzodiazepine-type new psychoactive substance detections in Australia: results from the Emerging Drugs Network of Australia – Victoria project 2020–2022. International Journal of Drug Policy. 2023;122:104245. DOI: 10.1016/j.drugpo.2023.104245.

7. Акимова В. Д., Барсегян С. С., Плетенева Т. В. Персонифицированный характер токсических эффектов на примере массовых несмертельных отравлений феназепамом и другими психоактивными веществами. Судебно-медицинская экспертиза. 2024;67(1):47–55.

8. Воронина Т. А. Ларионов В. Б., Головенко Н. Я., Неробкова Л. Н., Гайдуков И. О. Роль 3-оксиметаболита феназепама и леваны в реализации их нейротропного действия. Фармакокинетика и фармакодинамика. 2014;1:44–49.

9. Ivashchenko D. V., Rudik A. V., Poloznikov A. A., Nikulin S. V., Smirnov V. V., Tonevitsky A. G., Bryun E. A., Sychev D. A. Which cytochrome P450 metabolizes phenazepam? Step by step in silico, in vitro, and in vivo studies. Drug Metabolism and Personalized Therapy. 2018;33(2):65–73. DOI: 10.1515/dmpt-2017-0036.

10. Zastrozhin M. S., Skryabin V. Yu., Sorokin A. S., Petukhov A. E., Smirnov V. V., Pankratenko E. P., Grishina E. A., Ryzhikova K. A., Panov A. S., Savchenko L. M., Bryun E. A., Sychev D. A. CYP3A subfamily activity affects the equilibrium concentration of Phenazepam® in patients with anxiety disorders and comorbid alcohol use disorder. Pharmacogenomics. 2020;21(7):449–457. DOI: 10.2217/pgs-2019-0071.

11. Мирошниченко И. И., Платова А. И., Кузьмин И. И., Иващенко Д. В. Количественное определение феназепама и его активного метаболита в плазме крови человека при различных процедурах экстракции. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2024;13(3):199–207. DOI: 10.33380/2305-2066-2024-13-3-1609.

12. Bland J. M., Altman D. G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. The lancet. 1986;1(8476):307–310.

13. Rocci M. L., Devanarayan V., Haughey D. B., Jardieu P. Confirmatory reanalysis of incurred bioanalytical samples. The AAPS Journal. 2007;9(3):E336–E143.

14. Kelley M. Incurred sample reanalysis: it is just a matter of good scientific practice. Bioanalysis. 2011;3(9):931–932. DOI: 10.4155/bio.10.215.

15. Kringle R. O. An assessment of the 4-6-20 rule for acceptance of analytical runs in bioavailability, bioequivalence, and pharmacokinetic studies. Pharmaceutical research. 1994;11(4):556–560. DOI: 10.1023/a:1018922701174.

16. Giavarina D. Understanding Bland Altman analysis. Biochemia Medica. 2015;25(2):141–151. DOI: 10.11613/BM.2015.015.

17. Eastwood B. J., Farmen M. W., Iversen P. W., Craft T. J., Smallwood J. K., Garbison K. E., Delapp N. W., Smith G. F. The minimum significant ratio: a statistical parameter to characterize the reproducibility of potency estimates from concentration-response assays and estimation by replicate-experiment studies. Journal of Biomolecular Screening. 2006;11(3):253–261. DOI: 10.1177/1087057105285611.

18. Kocur A., Rubik J., Czarnowski P., Czajkowska A., Marszałek D., Sierakowski M., Górska M., Pawiński T. Therapeutic drug monitoring of mycophenolic acid (MPA) using volumetric absorptive microsampling (VAMS) in pediatric renal transplant recipients: ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry analytical method development, cross-validation, and clinical application. Pharmacological Reports. 2023;75(4):1026–1042. DOI: 10.1007/s43440-023-00509-w.

19. Mano Yu. Method validation studies and an inter-laboratory cross validation study of lenvatinib assay in human plasma using LC-MS/MS. Practical Laboratory Medicine. 2018;12:e00103. DOI: 10.1016/j.plabm.2018.e00103.

20. Marin C., Khoudour N., Millet A., Lebert D., Bros P., Thomas F., Ternant D., Lacarelle B., Guitton J., Ciccolini J., Blanchet B. Cross-Validation of a Multiplex LC-MS/MS Method for Assaying mAbs Plasma Levels in Patients with Cancer: A GPCO-UNICANCER Study. Pharmaceuticals. 2021;14(8):796. DOI: 10.3390/ph14080796.

21. Wickremsinhe E. R., Decker R. L., Lee L. B., Lelle E., Carlton L. A., Keller S. Y., Prakash A. Microsampling in pediatric studies: pharmacokinetic sampling for baricitinib (Olumiant™) in global pediatric studies. Bioanalysis. 2023;15(11):621–636. DOI: 10.4155/bio-2023-0044.

22. Meyer J. A., DeChenne S., Foerder C. A., Hengel S. M. Bioanalysis of tucatinib and metabolite, and a five-way cross-validation to support clinical pharmacokinetic analysis. Bioanalysis. 2022;14(22):1443–1452. DOI: 10.4155/bio-2022-0199.

23. Peris-Vicente J., Esteve-Romero J., Carda-Broch S. Validation of analytical methods based on chromatographic techniques: An overview. In: Anderson J. L., Berthod A., Estévez V. P., Stalcu A. M., editors. Analytical Separation Science. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA; 2015. P. 1757–1808. DOI: 10.1002/9783527678129.assep064.

24. Yang C., Liu Z., Fang Y., Cao X., Xu G., Wang Z., Hu Z., Wang S., Wu X. Development and validation of a clinic machine-learning nomogram for the prediction of risk stratifications of prostate cancer based on functional subsets of peripheral lymphocyte. Journal of Translational Medicine. 2023;21(1):465. DOI: 10.1186/s12967-023-04318-w.