Разработка, валидация и применение методики оценки жизнеспособности Escherichia coli с помощью проточной цитометрии

Введение. Около 30 % генно-инженерных терапевтических белков производится в Escherichia coli. При наработке рекомбинантных белков одним из факторов, определяющих эффективность процесса и качество продукта, является показатель жизнеспособности клеток. Важно контролировать жизнеспособность при формировании банков клеток и оценке их стабильности в процессе хранения, а также при разработке условий культивирования штаммов. Изменение условий хранения или культивирования может приводить к изменению структуры клеточной популяции с изменением соотношения жизнеспособных, мертвых и находящихся в апоптозоподобной гибели (ALD, apoptosis-like death) клеток. Одним из способов оценки популяций клеток может являться метод проточной цитометрии с окрашиванием.

Цель. Разработать, валидировать и апробировать методику оценки жизнеспособности E. coli с использованием проточной цитометрии.

Материалы и методы. Для оценки жизнеспособности клеток проводили окрашивание E. coli пропидия йодидом (PI) и аннексином V-FITC (An-V-FITC). При помощи двойного окрашивания определяли популяции клеток живых, мертвых и в ALD. Валидацию методики проводили согласно Государственной фармакопее, решению Совета ЕЭК № 85 от 03.11.2016 и рекомендациям ICH. Анализировали применимость методики при разработке условий создания банков клеток и их культивировании.

Результаты и обсуждение. Разработана методика оценки жизнеспособности E. coli с использованием проточной цитометрии и окрашивания PI с An-V-FITC, позволяющая оценить популяции клеток живых, мертвых и в ALD. По итогам валидации методики установлено ее соответствие критериям: специфичности (6 %), линейности (R² > 0,9), правильности (97–102 %), пределу количественного определения (подтвержден, 117 %), сходимости (1–10 %), внутрилабораторной прецизионности (2–17 %), аналитической области (6,4–100 %). При оптимизации условий создания банков клеток оценка жизнеспособности позволила определить, что для получения более 97 % жизнеспособных клеток после выхода из криоконсервации необходимо использовать соотношение объемов культуральной жидкости и криопротектора 3 к 1 при оптической плотности суспензии OD₆₀₀ = 15. При разработке процесса культивирования штамма методика позволила определить оптимальные условия, в результате в биореакторе за 8 часов индукции процент мертвых клеток увеличился всего на 2,5 %, а клеток в состоянии ALD – на 7 %.

Заключение. Разработана и валидирована методика для оценки жизнеспособности E. coli, она может использоваться на этапе разработки и производства терапевтических продуктов.

1. Rösner L. S., Walter F., Ude C., John G. T., Beutel S. Sensors and Techniques for On-Line Determination of Cell Viability in Bioprocess Monitoring. Bioengineering. 2022;9(12):762. DOI: 10.3390/bioengineering9120762.

2. Meyer C. T., Lynch G. K., Stamo D. F., Miller E. J., Chatterjee A., Kralj J. M. A high-throughput and low-waste viability assay for microbes. Nature Microbiology. 2023;8(12):2304–2314. DOI: 10.1038/s41564-023-01513-9.

3. Martini K. M., Boddu S. S., Nemenman I., Vega N. M. Maximum likelihood estimators for colony-forming units. Microbiology Spectrum. 2024;12:e03946-23. DOI: 10.1128/spectrum.03946-23.

4. Śliwa-Dominiak J., Czechowska K., Blanco A., Sielatycka K., Radaczyńska M., Skonieczna-Żydecka K., Marlicz W., Łoniewski I. Flow Cytometry in Microbiology: A Review of the Current State in Microbiome Research, Probiotics, and Industrial Manufacturing. Cytometry Part A. 2025;107(3):145–164. DOI: 10.1002/cyto.a.24920.

5. Agus R., Avino F., Lavrikova A., Myers B., Furno I. Flow cytometry study of Escherichia coli treated with plasma-activated water: confirming the absence of the viable but non-culturable state in bacteria. Frontiers in Microbiology. 2025;16:1592471. DOI: 10.3389/fmicb.2025.1592471.

6. McEvoy B., Lynch M., Rowan N. J. Opportunities for the application of real-time bacterial cell analysis using flow cytometry for the advancement of sterilization microbiology. Journal of Applied Microbiology. 2021;130(6):1794–1812. DOI: 10.1111/jam.14876.

7. Teixeira P., Fernandes B., Silva A. M., Dias N., Azeredo J. Evaluation by Flow Cytometry of Escherichia coli Viability in Lettuce after Disinfection. Antibiotics. 2020;9(1):14. DOI: 10.3390/antibiotics9010014.

8. Vanhauteghem D., Audenaert K., Demeyere K., Hoogendoorn F., Janssens G. P. J., Meyer E. Flow cytometry, a powerful novel tool to rapidly assess bacterial viability in metal working fluids: Proof-of-principle. PLoS ONE. 2019;14(2):e0211583. DOI: 10.1371/journal.pone.0211583.

9. Ou F., McGoverin C., Swift S., Vanholsbeeck F. Absolute bacterial cell enumeration using flow cytometry. Journal of Applied Microbiology. 2017;123(2):464–477. DOI: 10.1111/jam.13508.

10. Davey H., Guyot S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 2020;93(1):e72. DOI: 10.1002/cpcy.72.

11. Léonard L., Chibane L. B., Bouhedda B. O., Degraeve P., Oulahal N. Recent Advances on Multi-Parameter Flow Cytometry to Characterize Antimicrobial Treatments. Frontiers in Microbiology. 2016;7:1225. DOI: 10.3389/fmicb.2016.01225.

12. Lakshmanan I., Batra S. K. Protocol for Apoptosis Assay by Flow Cytometry Using Annexin V Staining Method. BIO-PROTOCOL. 2013;3(6):e374. DOI: 10.21769/bioprotoc.374.

13. Rieger A. M., Nelson K. L., Konowalchuk J. D., Barreda D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. 2011;(50):2597. DOI: 10.3791/2597.

14. Han G., Lee D. G. Antibacterial Mode of Action of β-Amyrin Promotes Apoptosis-Like Death in Escherichia coli by Producing Reactive Oxygen Species. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2022;32(12):1547–1552. DOI: 10.4014/jmb.2209.09040.

15. Lai M.-J., Huang Y.-W., Chen H.-C., Tsao L.-I., Chang Chien C.-F., Singh B., Liu B. R. Effect of Size and Concentration of Copper Nanoparticles on the Antimicrobial Activity in Escherichia coli through Multiple Mechanisms. Nanomaterials. 2022;12(21):3715. DOI: 10.3390/nano12213715.

16. Dwyer D. J., Camacho D. M., Kohanski M. A., Callura J. M., Collins J. J. Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis. Molecular Cell. 2012;46(5):561–572. DOI: 10.1016/j.molcel.2012.04.027.

17. Erental A., Sharon I., Engelberg-Kulka H. Two programmed cell death systems in Escherichia coli: an apoptotic-like death is inhibited by the mazEF-mediated death pathway. PLoS Biology. 2012;10(3):e1001281. DOI: 10.1371/journal.pbio.1001281.

18. Kwun M. S., Lee D. G. Bacterial Apoptosis-Like Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species by Quercetin in Escherichia coli. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2024;34(7):1395–1400. DOI: 10.4014/jmb.2403.03057.

19. Lin S., Lin Z., Zhou F., Wang D., Zheng B., Hu J. Polyoxometalate K₆[P₂Mo₁₈O₆₂] Inactivates Escherichia coli O157:H7 by Inducing recA Expression and Apoptosis-like Bacterial Death. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(14):11469. DOI: 10.3390/ijms241411469.

20. Choi H., Hwang J.-S., Lee D. G. Coprisin exerts antibacterial effects by inducing apoptosis-like death in Escherichia coli. IUBMB Life. 2016;68(1):72-8. DOI: 10.1002/iub.1463.

21. Li J., Ma L., Liao X., Liu D., Lu X., Chen S., Ye X., Ding T. Ultrasound-Induced Escherichia coli O157:H7 Cell Death Exhibits Physical Disruption and Biochemical Apoptosis. Frontiers in Microbiology. 2018;9:2486. DOI: 10.3389/fmicb.2018.02486.

22. Chen B., Zhao Y., Li Z., Pan J., Wu H., Qiu G., Feng C., Wei C. Immobilization of Phosphatidylserine by Ethanol and Lysozyme on the Cell Surface for Evaluation of Apoptosis-Like Decay in Activated-Sludge Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 2020;86(14):e00345-20. DOI: 10.1128/AEM.00345-20.

23. Sezonov G., Joseleau-Petit D., D’Ari R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. Journal of Bacteriology. 2007;189(23):8746–8749. DOI: 10.1128/JB.01368-07.

24. Erental A., Kalderon Z., Saada A., Smith Y., Engelberg-Kulka H. Apoptosis-like death, an extreme SOS response in Escherichia coli. mBio. 2014;5(4):e01426-14. DOI: 10.1128/mBio.01426-14.