Валидация метода Фолина – Чокальтеу для анализа флоротаннинов в свежих и штормовых выбросах бурых водорослях Ascophyllum nodosum (Phaeophyceae)

Введение. Флоротанины, являющиеся вторичными метаболитами, в основном вырабатываются бурыми морскими водорослями и относятся к классу полифенольных соединений, обладающих разнообразной биологической активностью. Бурые водоросли, выбрасываемые на берег штормом и составляющие угрозу для прибрежных экосистем, могут стать ценным источником полифенолов. Для количественного определения общего содержания полифенолов в природных образцах чаще всего применяется реактив Фолина – Чокальтеу (FCR).

Цель. Основной целью данного исследования является стандартизация и валидация спектрофотометрического определения общего содержания флоротаннинов с использованием FCR и демонстрация его применимости для анализа выброшенных штормом и свежих водорослей.

Материалы и методы. Образцы A. nodosum были собраны на защищенном пляже губы Оленица (66°27'15.7" с.ш. 35°18'20.4" в.д.) Кандалакшского залива (Белое море, Россия) на двух приливных уровнях: один находился во время отлива на глубине 0,6–1,0 м (свежие водоросли), а второй – на супралиторали в зоне заплеска волн (водоросли из штормовых выбросов). Полевой отбор проб проводился в период с июня по сентябрь. Очищенные водоросли доставляли в лабораторию, тщательно промывали чистой водой, лиофильно высушивали и измельчались в порошок. Функциональные группы, присутствующие в водорослях, идентифицировались с помощью инфракрасной Фурье-спектроскопии (ИК-Фурье). Спектрофотометрический метод с использованием реактива Фолина – Чокальтеу оптимизирован для анализа свежих и выброшенных штормом бурых водорослей и валидирован в соответствии с национальными и международными рекомендациями.

Результаты и обсуждение. Оптимальными условиями для анализа были время анализа, длина волны и стандартное вещество: 45 мин, 750 нм и флороглюцин, соответственно. В этих условиях валидация методики спектрофотометрии показала, что метод линейный (R² > 0,99), специфичный, точный, достоверный, воспроизводимый, надежный и простой в применении. Предел обнаружения и предел количественного определения составили 0,005 и 0,02 мг/мл, соответственно. Внутридневная (RSD 2,16 %) и междневная (RSD 2,84 %) прецизионность анализа была рассчитана. Оценка влияния матрицы показала, что она оказывает незначительное влияние (1,9 %) на количественное определение флоротаннинов. Содержание флоротаннинов в водорослях, выброшенных штормом, варьировалось от 59 до 101 мг/г, в то время как в свежесобранных водорослях было статистически достоверно выше (р < 0.01) и варьировалось от 71 до 135 мг/г. Максимальное накопление флоротаннинов в A. nodosum наблюдалось в период с июля по август, после чего наблюдалось снижение.

Заключение. Полученные в ходе данного исследования результаты могут быть применены для регулярного анализа содержания флоротаннинов в бурых водорослях и водорослях, извлеченных из штормовых отходов. Это возможно благодаря оптимизированному спектрофотометрическому методу с использованием реактива Фолина – Чокальтеу, который основывается на применении доступного и недорогого оборудования, имеющегося в большинстве лабораторий, что обеспечивает оперативность анализа. Данная методология соответствует требованиям фармацевтического анализа, обеспечивая надежность результатов при разработке лекарственных препаратов и рутинном контроле как свежего, так и штормовых выбросов A. nodosum.

1. Zheng H., Zhao Y., Guo L. A bioactive substance derived from brown seaweeds: Phlorotannins. Marine Drugs. 2022;20(12):742. DOI: 10.3390/md20120742.

2. Duan X., Agar O. T., Barrow C. J., Dunshea F. R., Suleria H. A. Improving potential strategies for biological activities of phlorotannins derived from seaweeds. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2025;65(5):833–855. DOI: 10.1080/10408398.2023.2282669.

3. Harb T. B., Chow F. An overview of beach-cast seaweeds: Potential and opportunities for the valorization of underused waste biomass. Algal Research. 2022;62:102643. DOI: 10.1016/j.algal.2022.102643.

4. Lastra M., López J., Neves G. Algal decay, temperature and body size influencing trophic behaviour of wrack consumers in Sandy beaches. Marine Biology. 2015;162:221–233. DOI: 10.1007/s00227-014-2562-z.

5. Meng W., Mu T., Sun H., Garcia-Vaquero M. Phlorotannins: A review of extraction methods, structural characteristics, bioactivities, bioavailability, and future trends. Algal Research. 2021;60:102484. DOI: 10.1016/j.algal.2021.102484.

6. Santos S. A. O., Félix R., Pais A. C. S., Rocha S. M., Silvestre A. J. D. The quest for phenolic compounds from macroalgae: A review of extraction and identification methodologies. Biomolecules. 2019;9(12):847. DOI: 10.3390/biom9120847.

7. Wekre M. E., Hellesen Brunvoll S., Jordheim M. Advancing quantification methods for polyphenols in brown seaweeds—applying a selective qNMR method compared with the TPC assay. Phytochemical Analysis. 2022;33(7):1099–1110. DOI: 10.1002/pca.3162.

8. Obluchinskaya E. D., Pozharitskaya O. N., Shevyrin V. A., Kovaleva E. G., Flisyuk E. V., Shikov A. N. Optimization of extraction of phlorotannins from the Arctic Fucus vesiculosus using natural deep eutectic solvents and their HPLC profiling with tandem high-resolution mass spectrometry. Marine Drugs. 2023;21(5):263. DOI: 10.3390/md21050263.

9. Torrisi L., Genovese G., Spagnuolo D., Lombardo D., Torrisi A., Cutroneo M. Highly visible photoluminescence in biocompatible liquids obtained by rehydration of Saccharina latissima algae at room temperature. Optical Materials. 2025;13:117245. DOI: 10.1016/j.optmat.2025.117245.

10. Najibi A., Gondo T. F., Turner C. A review of analytical techniques for characterizing phlorotannins in brown seaweeds: Current challenges and future prospects. Algal Research. 2025;20:104105. DOI: 10.1016/j.algal.2025.104105.

11. Bogolitsyn K., Druzhinina A., Kaplitsin P., Ovchinnikov D., Parshina A., Kuznetsova M. Relationship between radical scavenging activity and polymolecular properties of brown algae polyphenols. Chemical Papers. 2019;73:2377–2385. DOI: 10.1007/s11696-019-00760-7.

12. Torres P., Osaki S., Silveira E., dos Santos D. Y., Chow F. Comprehensive evaluation of Folin-Ciocalteu assay for total phenolic quantification in algae (Chlorophyta, Phaeophyceae, and Rhodophyta). Algal Research. 2024;80:103503. DOI: 10.1016/j.algal.2024.103503.

13. Stengel D., Connan S. Natural products from marine algae. Methods in molecular biology. New York: Humana Press; 2015. 439 p. DOI: 10.1007/978-1-4939-2684-8.

14. Koivikko R., Loponen J., Honkanen T., Jormalainen V. Contents of soluble, cell-wall-bound and exuded phlorotannins in the brown alga Fucus vesiculosus, with implications on their ecological functions. Journal of Chemical Ecology. 2005;31:195–212. DOI: 10.1007/s10886-005-0984-2.

15. Nunes N., Valente S., Ferraz S., Barreto M. C., de Carvalho M. P. Validation of a spectrophotometric methodology for a rapid iodine analysis in algae and seaweed casts. Algal Research. 2019;42:101613. DOI: 10.1016/j.algal.2019.101613.

16. Karthik R., Manigandan V., Sheeba R., Saravanan R., Rajesh P. R. Structural characterization and comparative biomedical properties of phloroglucinol from Indian brown seaweeds. Journal of Applied Phycology. 2016;28(6):3561–3573. DOI: 10.1007/s10811-016-0851-2.

17. Blanco-Pascual N., Montero M. P., Gómez-Guillén M. C. Antioxidant film development from unrefined extracts of brown seaweeds Laminaria digitata and Ascophyllum nodosum. Food Hydrocolloids. 2014;37:100–110. DOI: 10.1016/j.foodhyd.2013.10.021.

18. Leal D., Matsuhiro B., Rossi M., Caruso F. FT–IR spectra of alginic acid block fractions in three species of brown seaweeds. Carbohydrate Research. 2008;343(2):308–316. DOI: 10.1016/j.carres.2007.10.016.

19. Rocha Martins G., Ferreira Monteiro A., Lopes do Amaral F. R., Sant’Ana da Silva A. A validated Folin-Ciocalteu method for total phenolics quantification of condensed tannin-rich açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds extract. Journal of Food Science and Technology. 2021;58:4693–4702. DOI: 10.1007/s13197-020-04959-5.

20. Morais Galvão M. A., Oliveira de Arruda A., Ferraz Bezerra I. C., Assunção Ferreira M. R., Lira Soares L. A. Evaluation of the Folin-Ciocalteu method and quantification of total tannins in stem barks and pods from Libidibia ferrea (Mart. ex Tul) LP Queiroz. Brazilian Archives of Biology and Technology. 2018;61:e18170586. DOI: 10.1590/1678-4324-2018170586.

21. Vandeginste B. G. M., Rutan S. C. Handbook of chemometrics and qualimetrics. Part A. Amsterdam: Elsevier; 1997. 207 p.

22. Obluchinskaya E. D., Zakharova L. V. Comparative study of polyphenols of brown algae of the Barents sea and the White sea, as well as the waters of the North Atlantic. Chemistry of plant raw material. 2020;(4):129–137. DOI: 10.14258/jcprm.2020047755.

23. Bogolitsyn K., Parshina A., Ivanchenko N., Polomarchuk D. Seasonal variations in the chemical composition of Arctic brown macroalgae. Algal Research. 2023;72:103112. DOI: 10.1016/j.algal.2023.103112.

24. Stengel D. B., Connan S., Popper Z. A. Algal chemodiversity and bioactivity: Sources of natural variability and implications for commercial application. Biotechnology Advances. 2011;29(5):483–501. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2011.05.016.

25. Åberg P., Pavia H. Temporal and multiple scale spatial variation in juvenile and adult abundance of the brown alga Ascophyllum nodosum. Marine Ecology Progress Series. 1997;58:111–119. DOI: 10.3354/meps158111.

26. Parys S., Kehraus S., Pete R., Küpper F. C., Glombitza K.-W., König G. M. Seasonal variation of polyphenolics in Ascophyllum nodosum (Phaeophyceae). European Journal of Phycology. 2009;44(3):331–338. DOI: 10.1080/09670260802578542.

27. Apostolidis E., Karayannakidis P. D., Kwon Y.-I., Lee C. M., Seeram N. P. Seasonal variation of phenolic antioxidant-mediated α-glucosidase inhibition of Ascophyllum nodosum. Plant Foods for Human Nutrition. 2011;66:313–319. DOI: 10.1007/s11130-011-0250-4.

28. Tabassum M. R., Xia A., Murphy J. D. Seasonal variation of chemical composition and biomethane production from the brown seaweed Ascophyllum nodosum. Bioresource Technology. 2016;216:219–226. DOI: 10.1016/j.biortech.2016.05.071.

29. Pavia H., Brock E. Extrinsic factors influencing phlorotannin production in the brown alga Ascophyllum nodosum. Marine Ecology Progress Series. 2000;193:285–294. DOI: 10.3354/meps193285.

30. Obluchinskaya E. D., Pozharitskaya O. N., Gorshenina E. V., Daurtseva A. V., Flisyuk E. V., Generalova Y. E., Terninko I. I., Shikov A. N. Ascophyllum nodosum (Linnaeus) Le Jolis from Arctic: Its biochemical composition, antiradical potential, and human health risk. Marine Drugs. 2024;22(1):48. DOI: 10.3390/md22010048.

31. Gómez M., Barreiro F., López J., Lastra M. Evaluation of phenolic content of wrack debris on estuarine beaches: The effect on upper beach macrofauna. Marine Ecology. 2022;43(1):40–53. DOI: 10.1111/maec.12692.

32. Connan S., Goulard F., Stiger V., Deslandes E., Ar Gall E. Interspecific and temporal variation in phlorotannin levels in an assemblage of brown algae. Botanica Marina. 2004;47:410–416. DOI: 10.1515/BOT.2004.057.