Разработка и валидация методики определения нейтрализующих антител к инсулину (гларгин) в плазме крови человека

Введение. Проведение исследования иммуногенности терапевтических белков, таких как аналоги человеческого инсулина, является одним из актуальных и востребованных направлений в медицине и фармацевтике. Определение возможности выработки нейтрализующих антител к инсулину, уменьшающих терапевтических эффект принимаемого препарата у пациентов, является важным этапом для понимания фармакологического профиля лекарственного препарата. Применение клеточных методов анализа на антитела позволяет проводить определение нейтрализующих антител к инсулину.

Цель. Адаптация и валидация методики оценки иммуногенности инсулина в плазме крови человека.

Материалы и методы. В основе метода лежит использование клеточной линии iLiteTM Insulin Assay Ready Cells [1], в геном которой встроен репортёрный ген люциферазы светлячка (Firefly) под контролем инсулинозависимого промотора. При увеличении концентрации инсулина экспрессия люциферазы светлячка (Firefly) увеличивается, что позволяет использовать данную клеточную линию для оценки количества нейтрализующих инсулин антител. Для нормализации по количеству клеток и учёта влияния матричного эффекта исследуемых образцов используется второй репортёрный ген люциферазы Renilla, который экспрессируется под контролем конститутивного промотора. Активность обеих люцифераз измеряли с помощью набора реагентов DualGlo Luciferase Assay System (Promega) [2].

Результаты и обсуждения. Были установлены оптимальные концентрация инсулина и степень разбавления плазмы/сыворотки для определения нейтрализующих антител к инсулину. Показана долгосрочная стабильность нейтрализующих антител к инсулину в плазме крови человека более 3-х месяцев. Описанная методика были применена при сравнительном исследовании безопасности и иммуногенности аналогов инсулина (Гларгин).

Заключение. Разработана и валидирована методика определения антител к инсулину в K₂EDTA плазме крови человека с помощью тестсистемы на основе клеточной линии iLiteTM Insulin Assay Ready Cells; в основе метода лежит оценка связывания альфа цепи инсулина с высокоаффинным гетеродимерным рецептором CD220.

1. iLiteTM Insulin Assay Ready Cells (REF: BM3060), Product specification (Euro Diagnostica AB, Doc No: E-165-GB01). Available at: https://www.eurodiagnostica.com/downloadFile.php?fileName=upload/files/fileLibrary/BM3060%20Product%20Specification%20iLite%20Insulin%20Assay%20Ready%20Cells%20LABEL-DOC-0362%20v1%200.pdf.

2. Dual-GloR Luciferase Assay System Technical Manual (Promega) Available at: https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/0/dual-luciferase-reporter-assaysystem-protocol.pdf?la=en.

3. Аметов А. С., Карпова Е. В. Современный взгляд на инсулинотерапию у больных сахарным диабетом 2 типа в ежедневной клинической практике врача-эндокринолога. Эндокринология. 2008; 495: 71–5.

4. Авакова К. А. Оптимизация методов современной инсулинотерапии при лечении сахарного диабета. Авторефеф дисс. канд. мед. наук. 2009.

5. McKeage K., Goa K. L. Insulin glargine. Drugs. 2001; 61(11): 1599–1624. https://doi.org/10.2165/00003495-200161110-00007.

6. Davies M., Dahl D., Heise T., Kiljanski J., Mathieu C. Introduction of biosimilar insulins in Europe. Diabetic Medicine. 2017; 34(10): 1340– 1353. https://doi.org/10.1111/dme.13400.

7. European Medicines Agency. Abasaglar Insulin Glargine. EPAR Summary for the Public, 2014. Available at: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_Summary_for_thepublic/human/002835/WC500175384.pdf.

8. Determination of anti-Insulin neutralizing antibodies using iLiteTM Insulin Assay Ready Cells, Application note (Euro Diagnostica AB, Doc No: E-183-GB00). Available at: https://www.eurodiagnostica.com/downloadFile.php?fileName=upload/files/fileLibrary/Application%20note%20-%20Determination%20of%20antiinsulin%20neutralizing%20antibodies%20LABEL-DOC-0390%20v1%200.pdf.

9. Quantification of Insulin using iLiteTM Insulin Assay Ready Cells, Application note (Euro Diagnostica AB, Doc No: E-182-GB00). Available at: https://www.eurodiagnostica.com/downloadFile.php?fileName=upload/files/fileLibrary/Application%20note%20-%20Quantification%20of%20Insulin%20LABEL-DOC-0389%20v1%200.pdf.

10. FDA/CDER/CBER. Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products – Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection Guidance for Industry. FDA. 2019.

11. Home P., Derwahl K.-M., Ziemen M., Wernicke-Panten K., Pierre S., Kirchhein Y., Garg S. K. Anti-Insulin Antibodies and Adverse Events with Biosimilar Insulin Lispro Compared with Humalog Insulin Lispro in People with Diabetes. Diabetes Technol. Ther. 2018; 20: 160–170. https://doi.org/10.1089/dia.2017.0373.

12. Chatterjee S., Vashishta L., Waichale V. S., Nayak V. G., Melarkode R., Donnelly C. M., Sengupta N. Development and validation of a cellbased assay for the detection of neutralizing antibodies against recombinant insulins. J. Immunol. Methods. 2017 (452): 53–62. doi:10.1016/j.jim.2017.09.004.